中国のコロナワクチン第二相試験：ランセット

最近ランセットに載った中国のコロナワクチン第二相試験の論文である。副反応は当然多いが、免疫反応として抗体産生（中和はもちろん）とともにELISPOTではあるがT細胞反応も見ており期待は持てる（今のところ・・・）

概要

背景

本試験は，非複製アデノウイルス5型（Ad5）ベクターCOVID-19ワクチンの免疫原性と安全性を評価するための初の無作為化比較試験であり，有効性試験のための候補ワクチンの適量を決定することを目的としている．

方法

本試験は、中国・武漢の単一施設で実施された Ad5 ベクター COVID-19 ワクチンの無作為化二重盲検プラセボ対照第 2 相試験である。HIV陰性で重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に感染していない18歳以上の健康な成人が参加資格を持ち、1mLあたり1×10¹¹ウイルス粒子、5×10¹⁰ウイルス粒子、またはプラセボの投与量でワクチンを受けるように無作為に割り付けられた。参加者は2:1:1:1の割合で筋肉内注射を受けるように割り付けられた。無作為化リスト（ブロックサイズ4）は独立した統計学者によって作成された。参加者、治験責任医師、実験室分析を行うスタッフは、グループ割り付けのためにマスクされていた。免疫原性の主要評価項目は、28日目における受容体結合ドメイン（RBD）に対する特異的ELISA抗体反応の幾何学的平均力価（GMT）と中和抗体反応であった。安全性評価の主要評価項目は、14 日以内の副作用の発現率とした。主要評価項目および安全性解析には、少なくとも 1 回の投与を受けたすべての参加者が含まれている。本試験は ClinicalTrials.gov, NCT04341389 に登録されている。

所見

2020年4月11日から16日までの間に603名のボランティアを募集し、適格性のスクリーニングを行った。参加資格のある508人（男性50％、平均年齢39-7歳、SD12-5）が試験への参加を承諾し、ワクチン（1×10¹¹ウイルス粒子n=253、5×10¹⁰ウイルス粒子n=129）またはプラセボ（n=126）の投与群に無作為に割り付けられた。1×10¹¹および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では、RBD特異的ELISA抗体のピークは656-5（95％CI 575-2-749-2）および571-0（467-6-697-3）であり、28日目の血清転換率はそれぞれ96％（95％CI 93-98）および97％（92-99）であった。両ワクチンの投与により、生きたSARS-CoV-2に対する有意な中和抗体反応が誘導され、1×10¹¹および5×10¹⁰のウイルス粒子を投与された参加者では、それぞれ19-5（95％CI 16-8-22-7）および18-3（14-4-23-3）のGMTが得られた。ワクチン接種後の特異的インターフェロンγ酵素免疫スポットアッセイ反応は、1×10¹¹および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では253人中227人（90％、95％CI 85-93）および129人中113人（88％、81-92）で観察された。誘引性副作用は、1×10¹¹投与群で253例中183例（72％）、5×10¹⁰投与群で129例中96例（74％）に報告された。重篤な副作用は、1×10¹¹ウイルス粒子投与群で24名（9%）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群で1名（1%）で報告された。重篤な副作用は報告されなかった。

解釈

Ad5ベクター化されたCOVID-19ワクチンは、5×1010個のウイルス粒子で安全であり、1回の接種で大多数の人に有意な免疫反応を誘導しました。

資金提供

中国国家重点研究開発計画、国家科学技術大プロジェクト、カンシーノバイオロジクス

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方法

スタディデザインと参加者

Ad5 ベクター化 COVID-19 ワクチンの無作為化二重盲検プラセボ対照第2相試験は、武漢（中国湖北省）の単一施設で実施された。この試験は、ヘルシンキ宣言および臨床試験実施基準に基づいて実施された。試験開始前に独立したデータ安全性監視委員会が設置され、試験期間中の安全性データの監視が行われた。試験計画書は、中国の国家医薬品管理局と江蘇省疾病管理予防センターの機関審査委員会によって審査され、承認された。プロトコールはオンラインで公開されている。

対象者は18歳以上の健康な成人で、HIV陰性でSARS-CoV-2感染歴がなく、スクリーニング時に指先の血液を用いた市販のヒト免疫不全ウイルス抗体検出キット（InTec products、厦門市、中国）およびSARS-CoV-2迅速検査キット（Jinwofu、北京市、中国）で確認された者とした。参加資格は、インフォームドコンセントの内容を理解し、インフォームドコンセントに署名できること、予定されているすべての試験工程を完了できること、腋窩温が37.0℃以下であること、body-mass indexが18-5以上30-0以下であること、病歴や身体検査で確認された健康状態が全般的に良好であること、などとした。妊娠中または授乳中の女性は除外された。精神疾患、アレルギーの既往歴、重篤な心血管系疾患、その他の主要な慢性疾患を有する人も除外された。除外基準および除外基準の完全なリストは、プロトコールに記載されている。参加者は、オンラインの募集広告を介して募集された。参加資格のスクリーニングの前に、各参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

無作為化とマスキング

Ad5ベクターを用いたCOVID-19ワクチンは、北京生物工学研究所（北京、中国）とCanSino Biologicsによって開発され、武漢-Hu-1（GenBankアクセッション番号YP_009724390）をベースとした完全長スパイク遺伝子を発現する複製欠損型Ad5ベクターを含有していた。プラセボはワクチン賦形剤のみを含み、ウイルス粒子を含まなかった。実験用ワクチンとプラセボは同一の包装で、各バイアルにはランダム化番号が記載されており、唯一の識別子となっていた。1×10¹¹と5×10¹⁰のウイルス粒子のワクチンとプラセボは、2:1:1:1の比率で無作為化された。有資格者は、SASソフトウェア（バージョン9.4）を使用して独立した統計学者によって作成されたブロック化された無作為化リスト（ブロックサイズ4）に従って、無作為化番号を順次割り当てられ、同じ番号でラベル付けされた実験ワクチンまたはプラセボを注射された。無作為化とマスキングに関与した個人は、試験の残りの部分には関与していない。参加者、治験責任医師、実験室分析を行うスタッフは、グループ割り付けの際にマスキングを行った。

手順

参加者には、1×10¹¹または5×10¹⁰のウイルス粒子/mL、またはプラセボのワクチンを単回注射し、腕に筋肉内投与した。参加者は注射後30分以内に即時の有害反応がないかモニターされ、14日以内に注射部位または全身性の有害反応がないか、ワクチン接種後28日以内に有害事象がないかフォローアップされた。参加者が自己申告した重篤な有害事象は、試験期間中記録された。

9 ワクチン接種直前の 0 日目、接種後 14 日目および 28 日目に参加者から採血し、ELISA キット（北京万泰バイオファーム、北京、中国）を用いて受容体結合ドメイン（RBD）に対する特異的な抗体反応を測定した。ＲＢＤ特異的ＥＬＩＳＡ抗体検査の検出限界は１：４０であった。活性SARS-CoV-2ウイルス（SARS-CoV-2株/ヒト/CHN/Wuhan_IME-BJ01/2020、GenBank番号MT291831.1）または疑似ウイルス（スパイク糖タンパク質を発現する水胞性口内炎ウイルス疑似ウイルス系）に対する中和抗体反応、および接種前および接種後28日目の細胞免疫反応も測定した。活性SARS-CoV-2 ウイルスおよび疑似ウイルスに対する中和抗体検査の検出限界は、それぞれ 1:8 および 1:10 であった。血清中の不検出抗体価は、計算のために検出限界の半分の値を割り当てた。スパイク糖タンパク質のオーバーラップペプチドプールによって刺激されたインターフェロン（IFN）γの発現の細胞免疫応答を、酵素結合免疫スポット（ELISpot）アッセイ（Mabtech、ストックホルム、スウェーデン）として検出した。IFNγ-ELISpot反応で「陽性」とは、末梢血単核球1×10⁵個あたり少なくとも5個のスポット形成細胞、およびベースラインの2倍以上の増加と定義された。ワクチンベクターAd5に対する中和抗体価は血清中和アッセイを用いて測定した。

ワクチンベクターAd5に対する中和抗体価を血清中和法で測定した。フォローアップは、接種後14日目と28日目、接種後6ヶ月目に安全性と免疫原性の評価のために実施した。

結果

主な目的は、Ad5ベクターを用いたCOVID-19ワクチンの免疫原性と安全性を評価し、第3相有効性試験に向けたワクチン用量を決定することであった。安全性評価の主要評価項目は、注射後14日以内の副作用発現率とした。免疫原性の主要評価項目は、接種後28日目におけるRBD特異的ELISA抗体反応および活性ウイルスまたはシュードウイルスに対する中和抗体反応の幾何学的平均力価（GMT）で測定した。免疫原性の副次的評価項目は、接種14日目および6ヶ月目（6ヶ月間のデータは未入手）におけるRBD特異的ELISA抗体反応と、接種後28日目における特異的T細胞反応であった。体液性免疫反応の血清転換も副次的エンドポイントであり、接種後の力価がベースラインの4倍以上に上昇したものと定義した。副次的な安全性のアウトカムは、接種後0日目から28日目までの有害事象の発生と、6ヵ月までに報告された重篤な有害事象であった。有害事象については、中国国家食品薬品監督管理局の標準的なガイドラインに基づいて重症度を評価し、マスク解除前の予防接種との因果関係を評価した。安全性と免疫原性の層別分析は、ベースラインのAd5中和抗体価を1:200としたカットオフ値に基づいて行った。年齢と性別による免疫反応の事後分析、およびワクチン接種後28日目に体液性免疫反応が陽性または血清転換した複合エンドポイントを持つワクチン接種者の割合が示された。

統計解析

この第2相試験は、第1相試験の免疫原性データが得られる前に開始されたため、設計段階でのサンプル数は算出されていない。この第2相試験は、第1相試験の免疫原性データが得られる前に開始されたため、設計段階でのサンプルサイズの算出は行っていない。専門家の意見と中国国家医療製品管理局のワクチン臨床試験技術指針の最小サンプル数要件に基づき、全体のサンプルサイズを 500 名（1×10¹¹ ウイルス粒子投与群 250 名、5×10¹⁰ ウイルス粒子投与群 125 名、プラセボ群 125 名）とした。RBD特異的抗体については、1×10¹¹ウイルス粒子投与群 250 名、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群 125 名が、複数比較を考慮した場合、有意水準 0-017 の有意水準で、投与群間の対数伝達力価の差が 0-176、SD が 0-4 であることを 90%以上の検出力で示すことができた。

統計検定はα値0-05の両側検定とし、独立した統計学者がSAS（バージョン9.4）を用いて分析した。一次免疫原性解析は、ワクチン接種後の抗体検査のために注射と献血を受けた全参加者を含む全解析コホートで行い、安全性解析はワクチン接種を受けた全登録参加者で行った。RBD特異的 ELISA 抗体と中和抗体の相関分析を行い、ピアソン相関係数を算出した。抗体反応は、95%信頼区間を持つGMTとして報告された。対数変換された抗体価についてはANOVAを、正規分布していないデータについてはWilcoxon順位和検定を用いた。カテゴリーデータについてはχ2検定またはフィッシャーの厳密検定を使用した。治療群間で有意差が認められた場合は、Student Newman-Keuls 検定または関連する場合はBonferroni調整α値を用いて多重比較を行った。この試験は ClinicalTrials.gov, NCT04341389 に登録されている。

資金源の役割

本研究の資金提供者はプロトコールのデザインに関与したが、データ収集、統計解析、データ解釈、報告書の執筆には関与していない。すべての著者は、研究に含まれるすべてのデータに完全にアクセスし、出版に向けて提出するかどうかの最終的な責任を負っていた。

結果

2020年4月11日から16日までの間に603名のボランティアが募集され、適格性のスクリーニングが行われた（図1）。95人が除外され、試験への参加に同意し、ワクチンまたはプラセボに無作為に割り付けられた参加資格のある508人が残された。253人が1×10¹¹ウイルス粒子投与群、129人が5×10¹⁰ウイルス粒子投与群、126人がプラセボ群に無作為に割り付けられた。参加者の平均年齢は39～7歳（SD 12～5；範囲18～83）で、治療群をまたいで18～44歳が309人（61％）、45～54歳が134人（26％）、55歳以上が65人（13％）であった（表1）。508人の参加者のうち254人（50％）が男性であった。参加者のベースライン特性および既往のAd5中和抗体価は、治療群間でほぼ同程度であった。508人の参加者のうち、266人（52％）は既存免疫が高く、242人（48％）はAd5ベクターに対する既存免疫が低かった。参加者全員がワクチン接種後 28 日以内に予定されていた安全訪問を完了し、0 日目と 28 日目に採血を行い、506 名（99%以上）が 14 日目に献血を行った。Ad5ベクター化COVID-19ワクチンによって誘導されたRBD特異的ELISA抗体反応は14日目以降に検出され、1×10¹¹、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群でそれぞれ94-5（95％信頼区間80-5-110-8）、85-1（66-0-109-7）のGMTを示した（図2）。28日目のRBD特異的ELISA抗体のピークは、1×10¹¹ウイルス粒子投与群で656-5（575-2-749-2）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群で571-0（467-6-697-3）であった。1×10¹¹ウイルス粒子投与群では253名中244名（96％、95％信頼区間93～98）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では129名中125名（97％、92～99）が28日目にRBD特異的ELISA抗体の血清転換を示したのに対し、プラセボ群ではベースラインからの抗体増加は認められなかった。 ワクチン接種後28日目のGMTは、1×10¹¹および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群でそれぞれ19-5（95％CI 16-8-22-7）および18-3（14-4-23-3）であった（図2）。活性SARS-CoV-2に対する中和抗体反応の血清転換は、1×10¹¹ウイルス粒子投与群253人中148人（59％、95％信頼区間52-65）で、5×1010ウイルス粒子投与群129人中61人（47％、39-56）で、ワクチン接種後28日目に発生した。シュードウイルスに対する中和抗体反応のGMTは、1×10¹¹ウイルス粒子投与群で61-4（95％CI 53-0-71-0）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群で55-3（45-3-67-5）であり、それぞれ214（85％、95％CI 80-89）および107（83％、76-88）の血清転換が認められた。ライブウイルスおよびシュードウイルスに対する中和抗体反応には、両投与群間で有意差は認められなかった。

ワクチン接種前には、508人の参加者のうち266人（52％）が高い抗Ad5中和抗体を持っていた（表1）。抗Ad5免疫が低い参加者では、RBD特異的ELISA抗体と中和抗体のレベルが、抗Ad5免疫が高い参加者に比べて約2倍高かった（付録pp.2-3）。年齢の上昇もまた、RBD特異的ELISA抗体（p=0-0018）および生ウイルス（p<0-0001 span="">）または偽ウイルス（p=0-046、付録pp4-6）に対する中和抗体反応に独立した負の影響因子であることがわかりました。年齢に基づく層別分析では、55歳以上の参加者はワクチン接種後の両投与群で相対的に低い抗体反応を示し、特にライブウイルスに対する中和抗体の点で関連していることがわかった（付録pp7-8）。それにもかかわらず、ワクチン接種者の28日目のRBDに対するELISA抗体と中和抗体は、この集団ではプラセボ接種者よりも有意に高かった。ワクチンを受けた男性と女性の参加者は、ワクチン接種後に同様のRBD特異的ELISA抗体および中和抗体反応を示しました（付録pp9-10）。RBDに対するELISA抗体価およびシュードウイルスに対する中和抗体価はともに、ライブウイルスに対する中和抗体価と有意な相関があり、相関係数はそれぞれ0-75および0-72（p<0-0001 span="">）であった。

ベースラインELISpot T細胞応答は、508人の参加者のうち506人（>99％）で陰性であった。Ad5ベクター化COVID-19ワクチンは、1×10¹¹ウイルス粒子投与を受けた253人の参加者のうち227人（90％、95％CI 85-93）、および5×10¹⁰ウイルス粒子投与を受けた129人のうち113人（88％、81-92）において、28日目に有意なSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質特異的IFNγ-ELISpot応答を誘導した（図3）。1 × 10¹¹ ウイルス粒子投与群と 5 × 10¹⁰ウイルス粒子投与群の末梢血単核球 1 × 10⁵ 個当たりのスポット形成細胞数の中央値は 11-0 個（IQR 5-0-25-0）と 10-0 個（6-0-21-0）であった。

IFNγ-ELISpot反応は、28日目の投与群間で有意差は認められなかった。プラセボ群では、接種後に陽性のIFNγ-ELISpot T細胞応答は検出されなかった。ワクチン接種後のT細胞応答のスポット形成細胞の有意な増加は、28日目に既存の中和抗体が高値の参加者と低値の参加者の両方で観察された。Ad5に対する既存免疫が高い参加者では、両群の88％（1×10¹¹ウイルス粒子投与群では126人中111人、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では75人中66人）がワクチン接種後にIFNγ-ELISpot T細胞反応が陽性であった。参加者の性別および年齢は、ワクチン接種によって誘導されたIFNγ-ELISpot T細胞応答に差はなかった（付録p11）。さらに、1×10¹¹ウイルス粒子投与群の参加者253人中241人（95％、95％CI 92-97）、および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群の参加者129人中118人（91％、85-95）が、ワクチン接種後28日目にIFNγ-ELISpot T細胞反応陽性または生きたSARS-CoV-2に対する中和抗体の血清転換のいずれかを示した（付録p 12）。

ワクチン接種後14日以内に、1×10¹¹ウイルス粒子投与群では253人中183人（72％）、5×10¹¹ウイルス粒子投与群では129人中96人（74％）が少なくとも1つの誘引性副作用を報告したが、いずれもプラセボ群126人中46人（37％）よりも有意に高かった（p<0-0001 span="">；表2）。5×10¹⁰および1×10¹¹ウイルス粒子投与群で最も多かった全身性の誘引反応は、疲労42％および34％、発熱32％および16％、頭痛29％および28％であった。最も多かった注射部位勧誘反応は疼痛であり、1×10¹¹ウイルス粒子投与群の57％、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群の56％が報告した。ほとんどの副作用は軽度または中等度と報告されたが、1×10¹¹ウイルス粒子でワクチンを投与された253人中24人（9％）が重度（グレード3）の副作用を示し、これは5×10¹⁰ウイルス粒子投与群（p=0-0011）やプラセボ投与群（p=0-0004）と比較して有意に高かった。最もよく報告されたグレード3の副作用は発熱で、1×10¹¹ウイルス粒子投与群では253人中20人（8％）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では129人中1人（1％）に認められた。Ad5免疫の既往が高いこと、年齢の上昇、および男性性は、ワクチン接種後の発熱の発生が有意に低いことと関連していた（付録p13）。グレード3の反応は自己限定的であり、投薬なしで72～96時間以内に消失した(付録p14～15)。ワクチン接種後14日以内の非自発的な副作用は、1×10¹¹ウイルス粒子投与群19名（8%）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群7名（5%）、プラセボ群7名（6%）の参加者から報告されており、群間での差は認められなかった。全体では、1×10¹¹ウイルス粒子投与群196名（77％）、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群98名（76％）、プラセボ群61名（48％）が接種後28日以内に少なくとも1つ以上の有害事象を経験した。28日目のIgGおよびIgM迅速検査キット（Vazyme Biotech, number CD101, Nanjing, China）による検査では、参加者全員がSARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体が陰性であったため、本試験期間中にSARS-CoV-2に暴露された者はいなかった。

議論

本試験は、非複製Ad5ベクター化COVID-19ワクチン候補の免疫原性と安全性を評価するための最初の無作為化比較試験である。第2相試験は、初期段階の実験的ワクチンを大規模集団での有効性試験で有望なワクチン候補にするために必要かつ重要なステップである。本試験では、Ad5ベクター化COVID-19ワクチンを1×10¹¹ウイルス粒子および5×10¹⁰ウイルス粒子で単回注射することで、28日目にスパイク糖タンパク質に対する同程度の特異的な免疫反応が誘導されたが、両群間に有意な差は認められなかった。ワクチンは、1×10¹¹および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群において、参加者の59％および47％に中和抗体の血清転換を、96％および97％に結合抗体の血清転換を誘導した。IFNγ-ELISpotで測定した陽性特異的T細胞反応は、1×10¹¹および5×10¹⁰ウイルス粒子投与群でワクチンを受けた参加者の90％および88％で認められた。1×10¹¹ウイルス粒子投与群では95％の参加者、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群では91％の受給者がワクチン接種後28日目に細胞性免疫応答または体液性免疫応答のいずれかを示した（付録p12）。Ad5ベクターに対する既存の免疫と年齢の上昇は、ワクチン接種に対する特異的な免疫反応、特に体液性免疫反応を部分的に阻害する可能性がある。

本研究では、ワクチン接種後に報告された反応のほとんどは軽度または中等度であった。発熱、疲労、注射部位の痛みなどの副作用があった参加者の割合は、ワクチンを受けた人の方がプラセボを受けた人よりも有意に高かったが、28日以内の副作用は一般的に重篤ではなく、短期間（48時間以内）で消失した。Ad5ベクター化COVID-19ワクチンのいずれかの投与を受けた人の間で、グレード3の副作用はすべて1×10¹¹ウイルス粒子の投与群で報告されたが、5×10¹⁰ウイルス粒子の投与群では1つを除いて報告された。この試験では、予防接種後の一般的な有害事象のみを対象としているが、実験的なAd5ベクターCOVID-19ワクチンの安全性は良好であることが示唆されており、これは健康な成人を対象とした第1相試験の結果と一致している。

この第2相試験は、第1相試験のデータが完全に解析される前に開始された。高用量群（1～5×10¹¹ ウイルス粒子）では、低用量群（5×10¹⁰ウイルス粒子）や中用量群（1×10¹¹ ウイルス粒子）と比較して、グレード 3 の有害反応を報告した参加者の割合が高かった（それぞれ 17％ vs 6％、6％）。さらに、抗原量の増加は免疫原性の増加と関連していることが多いため、1×10¹¹ウイルス粒子のワクチン投与量は、2つの投与量のうちどちらが優れているかを予想した。そこで、本研究では、1×10¹¹と5×10¹⁰のウイルス粒子の投与群とプラセボ群をそれぞれ2:1:1:1の比率で無作為化し、前者の投与群を重視した。我々の予想とは対照的に、5×10¹⁰個のウイルス粒子を用いたワクチンは、1×10¹¹個のウイルス粒子を用いたワクチンよりも安全性が高く、免疫原性も同等であることがわかった。

参加者の年齢や抗Ad5免疫の既往が、候補ワクチンの安全性と免疫原性に影響を与えた可能性がある。発熱は、年齢の低下およびワクチンベクターであるAd5ウイルスに対する既往免疫の低さと関連していることを指摘した。グレード3の発熱を経験した21人のうち19人（90％）はAd5に対する既存免疫がなく、中和抗体価は検出値以下であった。年齢が高くなり、抗Ad5免疫が高い既往症があると、ワクチンに対する免疫反応が著しく低下することがわかった。特に55歳以上の高齢者では、抗Ad5免疫が高い参加者の中には、1回のワクチン注射で十分な体液性免疫反応が得られない場合があった。これらの結果は、高齢者ではAd5への曝露歴があり、Ad5に対する中和抗体が高いという知見と一致しており、このような人たちは、若くてAd5に対してナイーブな人たちよりも、Ad5ベクターを用いたCOVID-19ワクチンの高用量またはブースター用量レジメンに対する耐性が高い可能性があることを示す。既存の抗Ad5免疫は、候補となるAd5ベクター化COVID-19ワクチンが克服すべき最大の障害であると考えられている。同種プライムブースト免疫におけるAd5ベクターベースのエボラワクチンの過去の経験によれば、柔軟な追加投与（3ヶ月目から6ヶ月目の間）が免疫応答の増強を提供するための潜在的な解決策となるかもしれない。高齢者における追加接種の免疫原性と実行可能性については、第2b相試験でより多くのエビデンスが評価される予定である。しかし、本研究のワクチン接種者は、ワクチン接種後28日目に、1×10¹¹ウイルス粒子投与群で5-0倍、5×10¹⁰ウイルス粒子投与群で3-8倍の抗Ad5中和抗体の増加を示した（付録p17）。抗Ad5免疫の高レベルはワクチンのブースト効果に影響を与える可能性があるため、6ヶ月目まで参加者のAd5特異的抗体のダイナミックな変化を追跡し、ブースター投与のタイミングを決定することを計画した。

接種前後の参加者の血清状態をELISA、生のSARS-CoV-2または偽ウイルスに対する中和試験、およびELISpotによって測定し、候補ワクチンの体液性および細胞介在性免疫の証拠を得た。活性ウイルス中和抗体検査はバイオセーフティレベル3の試験室で実施する必要があるため、代替としてシュードウイルス中和抗体検査が開発された。しかし、シュードウイルスに対する中和抗体反応の大きさはライブウイルスに対するものよりも大きいことがわかったが、これは2つの検査の異なる方法論原理に関連している可能性がある。シュードウイルス中和試験では、血清中の特異的抗体がシュードウイルスに結合すると、シュードウイルスが細胞内に侵入するのを阻害し、細胞表面のルシフェラーゼの発現を低下させる。このように、全蛍光を検出することにより、シュードウイルスに対する中和抗体の量を算出することができる。中和抗体の検出は、ウイルス感染後の細胞病理効果を測定することで行う。一般に、両者の出力値は相関関係にあるが、検出感度が異なり、検出値が必ずしも一対一の対応関係にあるとは限らない。

中和抗体とT細胞応答の両方が、SARS-CoV-2に自然感染したCOVID-19患者において、ウイルスを排除し、病気の発症をコントロールする上で重要であった。さらに、CD4 T細胞応答は、細胞傷害性T細胞応答と中和抗体の成熟に重要である。従って、中和抗体に加えて、細胞を介した応答を評価することは、ワクチン候補の成功のために重要である。

私たちの試験にはいくつかの限界がある。第一に、この第2相試験は第1相試験のデータの完全な解析が可能になる前に開始されたため、事前に調査力に基づいてサンプルサイズを計算していなかったため、投与群間の違いを示す力が不足していた可能性があるのだ。第二に、本試験の参加者はすべて中国の武漢から来ている。しかし、成人の抗Ad5抗体価が1:200以上の中和抗体価を持つ成人の割合は、インドで約80％、ケニアで約78％、タイで約67％、ウガンダで約64％、南アフリカで約60％、シエラレオネで約45％、米国では30％未満であると報告されている。 候補のAd5ベクターワクチンは、既存の抗Ad5免疫が低い人では免疫原性に優れているが、既存の抗Ad5免疫が高い人では免疫原性が今回の第2相試験よりも劣ると予想される。第三に、この試験には小児は含まれていない。COVID-19は小児ではより良性の経過をたどっており、死亡例はほとんど報告されていないが、現在進行中のパンデミックの理想的な候補ワクチンは、すべての年齢層の感受性の高い集団をカバーしなければならない。第四に、我々はワクチン接種後28日以内のデータのみを報告しており、ワクチンによって誘発された免疫の持続性に関するデータは含まれていない。SARS-CoV-2に感染した患者の一部は、ウイルスに対する長期的な抗体を発現しない可能性があり、季節性コロナウイルスに感染し、COVID-19から回復した人、特に軽度の症状や無症状の感染者では、S抗体が急速に減少することが報告されている。第五に、本試験では、ワクチン接種後にSARS-CoV-2に曝露した参加者はいなかったため、候補ワクチンの有効性を評価することはできなかった。現在進行中の第 1 相および第 2 相試験では、6 ヶ月間の安全性データの収集と抗体持続性の評価を継続して行うことが可能である。最後に、これらの変化の臨床的意義を評価することは、保護免疫の相関関係が確認されておらず、COVID-19に対する中和抗体を測定するための基準がないために困難である。

今後の研究では、保護免疫の相関関係と保護閾値を確立し、高リスク集団の保護やアウトブレイク介入のためにAd5ベクター化COVID-19ワクチンを使用することの実現可能性を評価する必要がある。

WHOは、COVID-19に対抗する有望なワクチン候補の望ましい特性を定義することで、ワクチン開発を支援するための協力と努力を促進している。Ad5ベクター化COVID-19ワクチンを5×10¹⁰個のウイルス粒子で1回接種した場合の安全性は良好であり（接種後の一般的な副作用は限定的）、SARS-CoV-2に対する有意な特異的免疫反応を誘発する可能性があり、急性防御反応の緊急ワクチン接種の候補となる可能性がある。

結論として、本試験の結果は、Ad5ベクターを用いたCOVID-19ワクチンの免疫原性と安全性に関する知見を拡大した。この結果は、健康な成人を対象とした第3相有効性試験において、Ad5ベクター化COVID-19ワクチンを5×10¹⁰個のウイルス粒子で試験することを支持するものである。

C型肝炎にはなぜワクチンがないのか？

C型肝炎にはなぜワクチンがないのか？

久しぶりに看護学校で講義をしてきた。これまでは流行りの遠隔授業だった。対面授業を最近再開したとのことで、7月になり初めて今年の学生と対面した。今日は「肝臓」がテーマであったが、そのなかでワクチンが話題になった。なぜC型肝炎にはワクチンがないのか？

C型肝炎ウイルスはコロナと同じRNAウイルスなのだが・・・・

例えば「国立感染症研究所」のホームページによると

予防法として最も有効と思われるC型肝炎ワクチンは、依然として実用化されていない。C型慢性肝炎患者の血液中には、HCV蛋白に対する様々な特異的抗体が産生されるものの、ゲノムの多様性やエンベロープ蛋白にアミノ酸が変異しやすい領域が存在することなどから、中和抗体は産生されにくい。また、感染に伴ってT細胞応答も惹起されるが、例えばB型肝炎などの場合と比べてウイルス特異的な細胞性免疫は誘導されにくいと考えられる。このようなことが要因となって、HCVは宿主の免疫監視機構から逃れ、高率に持続感染が成立するものと考えられている。



例えばAMEDのホームページによると


HCVワクチンの開発は、これまで世界中の研究グループ試みてきましたが実用化されていません。HCVのエンベロープタンパク質を抗原として用いたワクチンは、マウス、モルモット、チンパンジー等のモデルにおいて中和抗体を誘導できることが報告されており、既に第一相臨床試験が行われています。またHCV抗原を発現させるウイルスベクターを用いたワクチンでは、細胞性免疫の誘導も報告されています。しかし感染・発症予防に必要とされている、中和抗体および細胞性免疫の両方を同時に誘導できるワクチンは開発されていません。


例えば「ウイルス肝炎研究財団」によると

C型肝炎ウイルス（HCV）感染予防のためのワクチンや免疫グロブリンは、現在のところ開発されていません。
これは、HCV粒子の外殻（エンベロープ）タンパクを作る遺伝子（E2/NS-1領域）が変異を起こし易いため、HCVに感染した個体がエンベロープに対する抗体（E2/NS-1抗体）を作った時には、既にその構造が変わってしまっていることから、一般的な意味での感染防御抗体としての働きを期待することができないということによります。このため、HCVのワクチンを開発することも難しいとされています。一方、HCVエンベロープタンパクに対する抗体陽性の大人数の血漿を集めて、ガンマグロブリンを作れば、感染予防に役立つ免疫グロブリンを作ることができるのではないかとの考え方も成り立たないわけではありません。現在も、様々な観点から研究が進められています。



学生の素朴な疑問はこうだ。

何十年かかってもワクチンを作ることができないウイルス感染症がこれまでもあるのに、新型コロナウイルスに対するワクチンがそうそう簡単にできるのでしょうか？

私は返す言葉がなかった。

北京から中和モノクローナル抗体：Cell

一週間前にnatureに中和抗体の報告が出て驚いたが、報告では2003年のSARS患者の回復期血液から得られたモノクローナル抗体であった。いわばpan-antibodyであり、まとめて
SARS-CoV-2の中和もできますよ・・・というものであった。多少の変異が将来生じても力価は衰えない可能性をうたっていた。

Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells

• Yunlong Cao 10
• Bin Su 10
• Xianghua Guo 10
• Chengfeng Qin
• Ronghua Jin
• X. Sunney Xie

さて5月17日のCellには「今回のCOVID-19回復期患者から中和抗体を作成した」という報告が出た。今年の二月に北京の病院で回復期にあった患者60人を解析し、14個のヒト型モノクローナル抗体を得ている。最有力の中和抗体（BD-368-2)のIC50はSARS-CoV-2のpseudovirus相手だと1.2ng/mlであり、（本物の）SARS-CoV-2相手でも15ng/mlである。

方法論は洗練されすぎていてちょっとついていけないが、だいたいならわかる。単一B細胞を濃縮しVDJシークエンシングしたものをベクターを介してヒトの抗体産生系に移行しモノクローナル・ヒト抗体を樹立するというものだ。後半の方法論はわかるが、前半のスクリーニング方法がちと分かりづらい。

最近好みの全訳を載せてみる。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）と命名された新規コロナウイルスによるコロナウイルス疾患2019（COVID-19）は、重篤なパンデミックとして世界的に流行している。（Callaway et al. SARS-CoV-2およびSARS-CoVはいずれもbetacoronavirus属のB系統に属し（Zhouら、2020年、Wuら、2020年）、それらのRNAゲノムは約82％の同一性を共有している（Chanら、2020年）。SARS-CoV-2が標的細胞に感染するメカニズムは、よく研究されており、最近報告されている（Hoffmannら、2020年、Wallsら、2020年）。SARS-CoVと同様に、SARS-CoV-2の表面上のスパイク（S）糖タンパク質は、ウイルスの膜融合および受容体認識を媒介する（Wallsら、2020年）。Ｎ末端領域のＳ１サブユニットは、ウイルスの付着に責任があり、宿主細胞上のＡＣＥ２受容体に直接結合する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。現在のところ、COVID-19については、ウイルス標的相互作用に対する有効な治療法は存在しない。

適応免疫応答によって産生された中和抗体を含む完治患者の血漿は、治療的モダリティとして使用された場合、軽度および重度のCOVID-19患者の両方の明らかな臨床的改善をもたらしている（Chenら、2020年、Shenら、2020年、Cao、2020年）。しかしながら、血漿を大規模に生産することができないため、治療的使用は限定的である。一方、回復期患者の記憶Ｂ細胞から単離された中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、そのスケーラビリティおよび治療効果のために、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ-２に対する有望な介入として機能する可能性がある。ウイルス表面タンパク質を標的とするヒト由来のmAbsは、HIV、エボラ、および中東呼吸器症候群（MERS）などの感染症に対する治療および予防効果をますます示している（Cortiら、2016、Wangら、2018、Scheidら、2009）。患者におけるそれらの安全性および効力は、複数の臨床試験において実証されている（Xuら、2019年、Caskeyら、2017年）。それらの利点にもかかわらず、ヒトメモリB細胞からの強力な中和mAbsのスクリーニングは、多くの場合、遅くて手間のかかるプロセスであり、これは、世界的な健康緊急事態に対応する場合には理想的ではない。SARS-CoV-2中和性mAbsをスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法が緊急に必要とされている。

VDJの組換えおよび体性超変異により、B細胞は多様なB細胞レパートリーを示すため、一度に1つのB細胞を分析する必要がある（Bassingら、2002年）。記憶Ｂ細胞の単細胞クローン増幅などの技術は、通常、mAbsを生成するために異種Ｂ細胞集団からペアの免疫グロブリン重軽鎖ＲＮＡ配列を得るために利用される（El Debsら、2012年、Niuら、2019年）。回復期患者からのエプスタインバーウイルス（EBV）不死化メモリB細胞のクローナル増幅は、HIV、デング熱、およびMERSなどのウイルス感染症に対する中和mAbsの単離に成功していることが証明されている（Scheidら、2009年、Burtonら、2009年、Cortiら、2015年）。しかし、時間のかかるインキュベーションおよびスクリーニングのステップのため、この技術は、成功したスクリーニングを完了するまでに少なくとも数ヶ月を要する。

一方、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）またはＢｅａｃｏｎ（Ｂｅｒｃｋｌｅｙ Ｌｉｇｈｔ）のようなオプトフルイディクスプラットフォームと組み合わせた単細胞ＲＴ-ＰＣＲは、単細胞ソーティング後の単一抗原結合メモリＢ細胞上で入れ子状ＰＣＲを行うことにより、数日で抗体配列を得ることができた（Ｔｉｌｌｅｒら、２００８年、Ｗａｒｄｅｍａｎら、２００３年；Ｗｒａｍｍｍｅｒｔら、２００８年；Ｌｉａｏら、２００９年）。この方法は、ＨＩＶおよびＭＥＲＳを含む様々な感染症における中和性ＭＡＢの効率的な単離につながっている（Ｓｃｈｉｄら、２００９年、Ｗａｎｇら、２０１８年）。それにもかかわらず、最近開発された10Xクロムを用いたB細胞受容体レパートリーのハイスループットシングルセルRNAおよびVDJシークエンシングは、B細胞スクリーニングスループットの点でシングルセルRT-PCRを凌駕している(Goldsteinら、2019年、Hornsら、2020年)。マイクロ流体ベースの手法は、1回の実行で数万個の単細胞B細胞からオートペアされた重鎖および軽鎖配列を得ることができ、HIVに対するヒト中和性mAbsの単離に成功している(Setliffら、2019)。

ここでは、回復期のCOVID-19患者からの抗原結合B細胞のハイスループットシングルセルRNAおよびVDJシークエンシングによって達成されたSARS-CoV-2中和抗体の迅速かつ効率的な同定を報告する。免疫グロブリンG1（IgG1）抗体を発現する8,500以上の抗原結合B細胞のクローンタイプが60人の回復期患者から同定された。その結果，14種類の強力な中和性mAbを同定し，その中で最も強力なmAbであるBD-368-2は，偽型および真正のSARS-CoV-2に対して1.2および15 ng/mLのIC50を示した．さらに、in vivo実験では、hACE2トランスジェニックマウスモデルを用いて、BD-368-2がSARS-CoV-2に対して強力な治療効果と予防的保護を提供できることが確認された（Baoら、2020、Yangら、2007、McCrayら、2007）。

さらに、SARS-CoV-2スパイクエクトドメイン三量体との複合体である中和性mAb BD-23の低温電子顕微鏡構造を解析し、そのエピトープがRBD/ACE2結合モチーフと重複していることを明らかにした。さらに、SARS-CoV-2とSARS-CoVの高い保存性に基づき、SARS-CoV中和抗体m396とCDR3Hの構造が類似していることを利用して、SARS-CoV-2に対する強力な中和mAbsが大規模な抗原結合クローンライブラリーから直接選択できることを示した（Prabakaranら、2006; Zhuら、2007）。以上の結果から、ハイスループットな単細胞シークエンシングにより、強力な治療・予防効果を有する中和抗体の同定が可能であることが示され、COVID-19のような流行・新興感染症への介入に大きく貢献できる可能性が示唆された。

結果

 完治期患者の単一B細胞のハイスループットシークエンス

従来の方法とは異なり、ハイスループットscVDJシーケンシング（scVDJ-seq）から得られた大規模なデータにより、インビトロ抗体発現に先立ってB細胞のクローンタイプの濃縮度を調べることが可能になった（Goldsteinら、2019年、Crooteら、2018年）。重鎖および軽鎖の両方について同一のCDR3領域を共有するB細胞を同一のクローンタイプにグループ化し、それらの濃縮度を、そのクローンタイプについて観察された細胞数に基づいて計算した。抗原活性化B細胞は、既存のナイーブB細胞およびメモリーB細胞からクローン選択および拡張を経て進むので（Muruganら、2018年、SeifertおよびKü ppers、2016年）、我々は、濃縮されたB細胞のクローンタイプが、高親和性SARS-CoV-2結合抗体および中和抗体を産生する可能性が高いという仮説を立てた。

この仮説を利用するために、まず、末梢血単核細胞（PBMC）を採取し、北京陽安病院のCOVID-19回復期患者12人からB細胞を単離した（表S1）。新鮮に単離したＢ細胞またはＣＤ２７＋メモリーＢ細胞サブセットについて、１０Ｘクロム５′ｍＲＮＡおよびＶＤＪシークエンシングを用いて、小条件ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）およびｓｃＶＤＪシークエンシングを行った（図１ＡおよびＳ１Ａ）。scVDJデータは、確かに濃縮されたIgG1クローンタイプを明らかにし（図S1FおよびS1H）、CD27+メモリーB細胞の選択は、発見されたIgG1クローンタイプ（図S1GおよびS1I）と同様に、シーケンシングされたメモリーB細胞の数（図S1DおよびS1E）を大きく改善した。しかしながら、濃縮されたIgG1+クローンタイプを含むメモリB細胞から選択された130のin vitro発現mAbs（表S2）から、BD-23と名付けられた2つのRBD結合mAbsのうちの1つだけが、偽型および真正のSARS-CoV-2に対して弱いウイルス中和能力を示した（図S1BおよびS1C）。RBD結合性mAbsと中和性mAbsの同定の効率が低いため、抗原親和性に基づいた選択が必要であり、スパイク/RBD結合性B細胞を大幅に富化させることができる。

抗原結合性単細胞B細胞のハイスループットシークエンシングによる中和性mAbsの効率的同定

RBD結合B細胞を濃縮するために、我々は磁気ビーズ分離（図1A）を介して抗原結合B細胞を選択するためにビオチン化されたRBDとSタンパク質の両方を利用した。選択は、B細胞の数の大きな減少を導入するので、十分な10倍負荷のために異なる患者からのPBMCを組み合わせた。合計で、６０人の回復期患者の抗原結合Ｂ細胞を６つの異なるバッチで分析した（表Ｓ１）。目標は中和性mAbsを産生することであったので、重軽鎖対にまたがる生産的なV-Jを持つことができなかったすべてのB細胞をフィルタリングした。合計8,558個の異なるIgG1提示抗原結合クローンタイプが検出された（表1）。さらに、scRNA-seqデータは、メモリB細胞の同定のためのmRNA発現に基づいた細胞タイピングを行うことを可能にした（図1BおよびS2）。ナイーブB細胞とメモリーB細胞の間には十分な分離が見られ、また、非B細胞とメモリーB細胞の間にも十分な分離が見られた。しかしながら、スイッチされた／スイッチされていないメモリＢ細胞と疲弊したメモリＢ細胞との間の明確な分離は、いくつかのバッチでは観察されないかもしれないが、これは主に、配列決定の深さが比較的低いことと、ｓｃＲＮＡ配列決定の細胞あたりに検出される遺伝子の数が少ないことに起因する（表Ｓ３）。

各シーケンシングバッチの実験詳細

エンリッチメント抗原とは、MACSプルダウンに使用した抗原を指す。バッチ4は、RBD結合B細胞をろ過したサンプルで実施した。PBMCステータスとは、使用したPBMCが以前に凍結されていたかどうかを指します。VJペアの細胞とは、完全長重鎖および軽鎖可変領域の両方が検出された細胞を指します。細胞は、それらが同一の重鎖および軽鎖CDR3 DNA配列を有する場合、同じクローンタイプに割り当てられます。図S2も参照のこと。

中和性mAbsの同定の効率を高めるために、中和性mAbsを産生する可能性が低いクローンタイプをフィルタリングするための一連の基準を開発した（図1D）。第一に、IgG1-発現B細胞がウイルス刺激に強く反応するので、IgG1-発現B細胞を含む濃縮されたクローンタイプのみを選択した（図1CおよびS3A）（Vidarssonら、2014）。第二に、IgG2-発現B細胞は通常、ウイルス性病原体に対して弱く反応するため、IgG2-発現クローンタイプは理想的な候補として含まれなかった（Iraniら、2015）。次に、2％よりも高い体細胞性超変異率（SHM）を有するB細胞を含まないクローンタイプは、不十分な親和性成熟を示し、除外された（Crooteら、2018; Methorら、2017）。最後に、疲弊した記憶Ｂ細胞およびナイーブＢ細胞は抗原刺激に対してより効果的に反応しないので（Moir and Fauci, 2014）、疲弊した記憶Ｂ細胞またはナイーブＢ細胞のみを含むクローンタイプは、理想的な候補として考慮されなかった（図１ＢおよびＳ２）。これらを合わせると、濃縮されたクローンタイプから合計169個の理想的な候補が選択され、トランスフェクションによりHEK293細胞で発現された（表S2）。一方、47個の非理想的な候補もまた、我々の選択基準の有効性を検証するための参考としてin vitroで発現させた（表S2）。

精製したmAbsをELISAおよび表面プラズモン共鳴（SPR）によりSARS-CoV-2 RBD/スパイク反応性を調べたところ，149種類のS結合性mAbsが同定され，そのうち半数以上がRBDに結合していた．さらに，SARS-CoV-2シュードウイルスシステムを用いて，ELISA陽性の全mAbsの中和能を調べた．我々は、RBD結合性mAbsのみがシュードウイルス中和効果を示し（図1E）、KdがACE2/RBDの解離定数（15.9 nM）より小さいかそれに近いRBDに結合したmAbsのみが（図S5B）、SARS-CoV-2シュードウイルスに対して有意な中和効果（IC50 < 3 μg/mL）を有することを発見した（図S4AおよびS4B）。完全長Sタンパク質とRBDタンパク質の両方がRBD結合mAbsを濃縮することができますが、異なる効率で（図1F）。RBDタンパク質を濃縮抗原として使用した場合、Sタンパク質を使用した場合と比較して3倍のRBD ELISA陽性率が得られた。最も重要なことは、理想的な候補から選択されたmAbsは、強力なRBD結合性mAbs（Kd < 20 nM）およびSARS-CoV-2中和性mAbsの同定において、それぞれ46％および25％の効率を示したことである（図S3D）、これは非理想的なmAbs候補と比較して有意に高い（図S3BおよびS3C）。

SARS-CoV-2に対する高い中和力を有する濃縮クローンタイプのmAbsの開発

濃縮されたクローンタイプから分離された中和性mAbのうち，7種類のmAbはSARS-CoV-2偽ウイルスに対してIC50が0.05 μg/mL以下で強力な中和能を示した（図2Aおよび2C）．最も強力なmAbであるBD-368-2は，BD-368と同じクローンタイプから選択されたものであり（図1C），IC50は1.2 ng/mLであった．7 種類の mAb はいずれも RBD に nM またはサブ nM の Kd で強く結合しており（図 S5A）、ACE2 と RBD との結合を競合的に阻害していた（図 5C および 5D）。本物のウイルスに対するそれらの中和の可能性を評価するために、我々は、COVID-19患者から分離された本物のSARS-CoV-2を使用して、プラーク低減中和試験（PRNT）を実施した。試験したすべてのmAbsの中で、BD-368-2は15 ng/mLのIC50を持つ真正ウイルスに対して最も高い効力を示した（図2Bおよび2C）。PRNTによって示された本物のウイルスの中和をさらに検証するために、我々は、本物のSARS-CoV-2に対してBD-218を使用して細胞病理学的効果（CPE）阻害アッセイを行った。BD-218は、1.2μg/mLの濃度で、3つのレプリケートすべてにおいて完全なウイルス阻害を示した（図S6AおよびS6B）、PRNTの結果と一致した。これらのデータは、抗原結合B細胞のハイスループットな単細胞シークエンシングによって、回復期の患者から非常に強力な中和性mAbsが同定され得ることを示している。

BD-368-2はhACE2マウスにおいて高い治療効果と予防効果を示した

特定された中和mAbsが、in vivoでSARS-CoV-2に対する治療的介入および予防的保護として機能し得るかどうかを評価するために、SARS-CoV-2に感染したhACE2トランスジェニックマウス（Baoら、2020年）において、BD-368-2の中和効果を試験した。BD-368-2は、偽型および本物のSARS-CoV-2の両方に対して最高の効力を示すので、選択された。合計９匹のｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを本研究で使用し、３つのグループ（Ｎ＝３）に等しく分割した。ウイルス感染の24時間前に、hACE2トランスジェニックマウスにBD-368-2を20mg/kg（マウスの体重に対して）腹腔内注射することで予防効果を調べた（図3A）。治療群では、感染の2時間後に20mg/kgのBD-368-2を注射した。陰性対照として、H7N9ウイルスに対するIgG1抗体である20mg/kg HG1Kを感染の2時間後に注射した。感染後5日間、各マウスの体重を毎日記録したところ（図3A）、治療群と予防群では体重が維持されていたのに対し、陰性対照群では有意に体重が減少していた（図3B）。このことから、感染前後にBD-368-2を投与することで、SARS-CoV-2感染マウスの生理状態を大幅に改善することが可能であることが示唆された。さらに、5dpiでの肺のqRT-PCRによるウイルス負荷を解析したところ（Yang et al. さらに、感染後 2 時間後に BD-368-2 を投与すると、マウス肺におけるウイルスコピーが 3～4 log 減少し、SARS-CoV-2 の複製を効果的に抑制できることを示した（図 3C）。以上のことから，BD-368-2 は生体内で高い治療効果と予防効果を示した。

三量体スパイク蛋白質に結合した中和性mAbの低温電子顕微鏡構造

SARS-CoV-2に対する中和性mAbsは，濃縮されたクローンタイプを解析した結果，効率的に同定された．しかし、各患者のB細胞のサンプリングが浅かったため、大部分のクローンタイプは濃縮されていなかった。しかしながら，非濃縮抗原結合性クローノタイプは，今後の中和性mAbの同定のための貴重なライブラリーとして残っている．恣意的な選択は、弱い抗原結合性mAbsの割合が高くなる可能性があり、また、抗原のプルダウン中に非特異的に結合する傾向があるため、非濃縮化クローンタイプのための新しい抗体選択基準が必要である。以前、人々は、より良いmAbs選択のためにIg-seqデータをアノテーションするために抗体構造予測を使用してきた（DeKoskyら、2016）。リファレンス中和mAbsと類似のCDR3H構造を共有するmAbsを選択することにより、構造アノテーションアプローチは、Ig-seqの性能を向上させるだけでなく、in vitro抗体の成熟化にも成功していることが証明されている（Kovaltsukら、2017年、Krawczykら、2014年、Sela-Culangら、2014年）。これらの結果に触発されて、CDR3Hに基づく構造予測は、回復期患者からのscVDJ-seqデータのアノテーションにも役立ち、それがSARS-CoV-2に対する中和mAbsの同定の効率を向上させるのに役立つかもしれないという仮説を立てた。

しかし、主な難点は、参照抗体構造の選択にある。現在までのところ、SARS-CoV-2中和用mAbの構造はProtein Database（PDB）に記録されておらず、これが参考となる可能性があります。この問題に対処するために、我々は、BD23-FabのS字型エクトドメイン三量体との複合体の低温電子顕微鏡構造を3.8Åの分解能で解いた（図4AおよびS7、表S4）。ここでは、Sエクトドメインは、以前に報告されているように非対称な構造を採用しています（Wrappら、2020）、1つのプロトマー（mol A）のRBDは "上 "の位置を採用し、他の2つのRBD（mol BおよびC）は "下 "の位置を採用しています。この3D再構成では、単一のBD23-Fabは、S三量体ごとに観察され、それは原形質Bの "ダウン "のRBDを結合しています。現在の分解能では、BD23-FabとRBDの間の分子間相互作用の詳細な解析をサポートしていませんが、BD23のエピトープは、ACE2が認識しているモチーフと重複していることが明らかになっています。実際、RBDとACE2の複合体構造を比較すると、BD23-FabはACE2と競合してRBDに結合していることが明らかになった（図4C）。この観察は、BD-23のSARS-CoV-2中和能力がACE2-RBD結合の破壊に由来することを示唆しており、これは、以前に同定されたSARS-CoVに対する中和mAbsと非常に類似している(Prabakaranら、2006; Yuanら、2020)。実際、いくつかの研究は、SARS-CoV中和mAbsがSARS-CoV-2を交差中和し得ることを示唆しており（Wangaら、2020年；Tianら、2020年、Lvら、2020年）、これは、SARS-CoVとSARS-CoV-2のRBDの間の類似性をさらに強調している。全体として、構造観察およびSARS-CoVとSARS-CoV-2の間の高い保存性は、SARS-CoV中和性mAbsの結晶構造を参考にして、類似のCDR3H構造を共有するSARS-CoV-2抗原結合クローンタイプをスクリーニングして中和性mAbsを同定することも可能であることを示唆している。

CDR3Hの構造類似性に基づく強力な中和性mAbsの選択

CDR3Hに基づいて予測されたIgG1-presenting clonotypeの構造をFREADを用いて、PDBデータベースに登録されているSARS-CoV中和用mAbsの結晶構造とBD-23の構造を比較した。残念ながら、BD-23と高いCDR3H構造類似性を示すIgG1を提示するクローンタイプはなかった。しかしながら、合計12個のIgG1クローンタイプは、PDB ID 2dd8および2ghw（表S2；図5C）と高い構造類似性を示し、これらはそれぞれ、以前に単離されたSARS-CoV中和mAbs m396および80Rに対応する（Prabakaran et al. 今回同定されたmAbsのCDR3H配列はm396（2dd8）と高い相同性を有しており（図5A）、ACE2/RBD結合を阻害することでSARS-CoVを中和する（図5D）。

驚くべきことに、12種類のmAbsのうち7種類のmAbsが強いRBD結合親和性を示し、偽型SARS-CoV-2に対して強力な中和能を示すことがわかった（図5Bおよび5C）。また，BD-503，BD-508，BD-515の3つの代表的なmAbsについても，真正のSARS-CoV-2に対する中和力をPRNTで確認し，高い中和力を示した（図5E，5F）．さらに、これらのmAbsは、重鎖にはVH3-66/JH6またはVH3-53/JH6遺伝子セグメント、軽鎖にはVLK1-9またはVLK1D-33/39遺伝子セグメントによって大部分がコードされていた（図5C）。アミノ酸配列とVDJの組み合わせが類似していることから、これらのmAbsが同じ系統に由来するかどうかを疑問視した。RNA変異解析の後、我々は、これらのmAbsのどれもが同じ系統に由来するものではなく、同じ患者に由来するものではないことを発見した。これらの観察を合わせると、特定のSARS-CoV-2エピトープに結合するステレオタイプのB細胞受容体が、HIV、インフルエンザ、およびC型肝炎で観察されてきたものと同様に、異なる個体に存在する可能性があることが示唆される（Gornyら、2009年、Ekiertら、2009年、Marascaら、2001年）。実際、二重抗体サンドイッチELISAを用いたエピトープビニング実験により、BD-503、BD-508、およびBD-515はエピトープが重複している可能性が高いことが示されている（図6）。しかし、これらのエピトープが大きく保存されているかどうかを確認するためには、正確なエピトープを得るためには、より多くの構造解析が必要である。

議論

新しい中和性 mAbs の発見効率を向上させるために、in vitro 発現前の抗体提示 B 細胞の系統解析を適用した。scRNA と scVDJ シーケンシングから得られる大規模な単細胞分解能データは、ハイブリドーマや単細胞 RT-PCR ベースの技術では容易には達成できない系統解析を行う機会を与えてくれた。各クローンタイプの濃縮度数を計算できることは、自然なクローン的に拡張されたB細胞系統の優先的な選択を可能にするだけでなく、抗原濃縮ステップ中の非特異的抗原結合の偽陽性率を減少させることにもつながる（図1A）。単一細胞レベルでのmRNA発現の同時測定は、さらに個々のB細胞の細胞タイピングを可能にし、これは疲弊したナイーブなB細胞サブセットを除去するために重要である。しかし、現在の浅いscRNAシーケンスでは、疲弊したメモリB細胞と非疲弊したメモリB細胞を正確に分離することはほとんどできない。したがって、中和性mAbsの同定を改善するために、排出されたメモリB細胞を除去することの有効性をさらに評価するためには、scRNAライブラリのより深い配列決定が必要である。

クローン的に濃縮されたB細胞のクローンタイプの他に、配列決定されたB細胞の大部分は、本研究では利用されなかったが、潜在的な中和性mAbsの貴重なライブラリとして残った。それにもかかわらず、濃縮されていないため、濃縮されていないB細胞の大規模なプールからmAbsを選択することが問題となっていた。そこで我々は、CDR3H構造予測などのバイオインフォマティクスに基づいた選択アプローチを利用した。SARS-CoV中和抗体m396とCDR3H構造が非常に類似しているmAbsは、SARS-CoV-2に対して驚くほど高い中和力を示した。VDJ遺伝子セグメントの大部分が保存されており、これらのmAbsのエピトープが重複している可能性が高いことから、SARS-CoV-2に対するステレオタイプのB細胞受容体が存在することが示唆された。異なる個体からVH3-66/JH6またはVH3-53/JH6をコードする重鎖に基づいて選択されたmAbsの予備的研究は、実際に高力価のSARS-CoV-2中和mAbsの高い割合を明らかにし（データは示されていない）、SARS-CoV-2に対するステレオタイプのB細胞受容体が存在することを支持する。

72個のS1/S2（非RBD）結合mAbsが同定されたが、いずれもシュードウイルス中和能力を示さなかった。非RBD結合性中和mAbsがMERS-CoVに対して観察されたので、これは興味深い結果であった（Xuら、2019）。抗原の異なる領域を標的とする抗原結合B細胞クローンタイプの残りのプールからのより多くの抗体は、観察をさらに確認するために、中和能力についてスクリーニングされるであろう。さらに、疑似ウイルスのより多くの株を利用して、ウイルス変異後の、特にＲＢＤ領域における中和脱出の潜在的なリスクを調べることができる（Wangら、2018）。ウイルス変異に対する可能性のある解決策は、2つの異なるエピトープを標的とする2つの強力なmAbsを組み合わせることである可能性がある。エピトープビニングの結果（図6）は、BD-368-2と同じエピトープを共有するBD-368が、ほとんどの強力な中和mAbsで非重複エピトープを示すことを示唆した。BD-368-2 と他の中和性 mAb を組み合わせた抗体カクテルは，SARS-CoV-2 の中和力を個々の mAb と比較して大幅に向上させることができ，また，両方のエピトープに変異が現れる可能性が低いため，突然変異の逃避を大幅に防ぐことができると考えられた．

世界的なパンデミックとしてのCOVID-19の継続的な普及は、SARS-CoV-2感染症に対する効果的な介入を必要としている。我々が同定した強力な中和抗体は、hACE2 トランスジェニックマウスを用いた結果からも明らかなように、有効な治療法および予防法を提供する可能性がある。現在、BD-368-2を用いた臨床試験が進行中である。本研究で得られたハイスループットシングルセルシーケンシング法の応用は、COVID-19以外の感染症への応用も可能であり、将来のパンデミック時に迅速に中和抗体を発見するための技術的な予備軍としての役割を果たす可能性がある。