研究者のブログ：Allelic exclusionや坂野 仁先生のこと

研究者のブログ

世の中には現役の研究者でありブログを書いておられる方がいる。中にはとても波長が合う方（こちらの一方的な片思いであるから、ブログ主が迷惑に思われる方も多いでしょうから、固有名は触れません）のが何人かいらっしゃって、小生ときどきお邪魔するのが最近の愉しみである。ここしばらくの小保方さん騒動で初めて気が付いたブログがいくつもあって面白い。

小生小保方さんの論文を最初に読み、そしてブログに感想を書いたときに気が付かなかったことがある。TCRの再構成におけるAllelic exclusionのことである。「TCR再構成では二本のアリルのうち一本が再構成に成功すれば、残りの一本の再構成は起こらない」というように教科書では説明される。再構成が起こらない方のアリルからはTCRは発現も翻訳も起こらない。というものである。

小生が誤解していた。ああそうだなと思った。訂正すべきかしら・・・・。

といろいろ考えていた時期に、

これまたいろんな方々のブログを読ませて頂いて、実に勉強になった。Allelic exclusionも奥が深いということだ。

1. 教科書に書いてあることをひたすら書き連ねる方もおられる。 
2. 教科書に書かれていることで最初は説明されていたが、そのうち免疫ゲノム遺伝学の専門家から説明を受けられ、教科書以外の例外的メカニズムについてご自分が学んだことを教えてくださる方もいた。

そしてそのうちゲノム再構成についてならもとはといえば利根川進先生だったよなと思い、ほどなく「坂野　仁」先生のことを思い出した。

坂野先生が免疫グロブリンの遺伝子再構成やTCR再構成の論文で盛んだったのは1980年頃だったようだ。小生が生まれて初めてnatureの論文というものをコピーしたのは、ちょうどその頃のことであり、その論文が抗体遺伝子かTCRの再構成のお話しだったことが強く記憶に残っている。あとから知ったのだが坂野　仁先生はそのゲノム改変研究の推進役であった。

実はその後の坂野先生のことはよく知らずにいたのだが、今回坂野先生のことを思い出していろいろ調べるとこれが面白いの。

坂野先生その後嗅覚レセプターのゲノム学に進まれたのね。面白いなあ。ゲノムの改変に興味がヒト一番強い小生としては、嗅覚レセプター研究、これはいわば当たり前の方向性に見えるが、実はこれも後付の論理でなのである。 あとから振り返れば整合性があるが、当時この方向に進まれるたというのが凄いと思う。利根川さんが神経科学に進んだのは有名であるが、坂野先生のことまでは不詳不案内でございました。

プロモーターやエンハンサーによる細胞発現アトラス：理研からnatureに二報

理研林崎先生のところから「プロモーターやエンハンサーによる細胞発現アトラス」が出た。
理研からnatureで二報となると、先の小保方論文以来であるが、今度は更に立派なのは二報ともarticleであることだ。
林崎先生も息の長い研究者であること・・・・。

Nature507,455–461(27 March 2014)

プロモーターレベルでの哺乳類発現アトラス
A promoter-level mammalian expression atla

The FANTOM Consortium and the RIKEN PMI and CLST (DGT)

Received 04 January 2013

Accepted 16 October 2013

Published online 26 March 2014

哺乳類の個体を構成する数百種類の細胞の多様性、発生経路および空間的構成は、転写の調節によって制御される。本論文では、1分子レベルでのcDNA塩基 配列解読（1分子CAGEシーケンス）を用いて、ヒトおよびマウスの初代培養細胞、細胞株および組織において転写開始部位（TSS）およびその発現量を マップし、ヒトの体全体にわたる哺乳類遺伝子発現についての系統的な地図を作製した。この中で、真に「ハウスキーピング」に関わっている遺伝子はわずかで ある一方、多くの哺乳類のプロモーターは、独立した細胞種特異的発現プロファイルを持つ数個の近接した個別のTSSで構成される複合的な領域であることを 見いだした。細胞種特異的なTSSはおのおの異なる速度で進化しているが、一方、広範な組織で発現している遺伝子のプロモーターは高度に保存されている。 プロモーターに基づく発現解析は、細胞の状態を規定する主要な転写因子を明らかにし、それらの転写因子と結合部位モチーフを関連付けている。同定された新 規転写産物の機能は、共発現解析およびオントロジーエンリッチメント解析により予測できる。FANTOM5（functional annotation of the mammalian genome 5）プロジェクトが示した哺乳類の細胞種特異的なトランスクリプトームの包括的な発現プロファイルおよび機能アノテーションは、生物医学研究に広範囲に応 用可能である。 

Regulated transcription controls the diversity, developmental pathways and spatial organization of the hundreds of cell types that make up a mammal. Using single-molecule cDNA sequencing, we mapped transcription start sites (TSSs) and their usage in human and mouse primary cells, cell lines and tissues to produce a comprehensive overview of mammalian gene expression across the human body. We find that few genes are truly ‘housekeeping’, whereas many mammalian promoters are composite entities composed of several closely separated TSSs, with independent cell-type-specific expression profiles. TSSs specific to different cell types evolve at different rates, whereas promoters of broadly expressed genes are the most conserved. Promoter-based expression analysis reveals key transcription factors defining cell states and links them to binding-site motifs. The functions of identified novel transcripts can be predicted by coexpression and sample ontology enrichment analyses. The functional annotation of the mammalian genome 5 (FANTOM5) project provides comprehensive expression profiles and functional annotation of mammalian cell-type-specific transcriptomes with wide applications in biomedical research.


Nature507,462–470 (27 March 2014)

ヒトの細胞種と組織全体にわたる活性化エンハンサーアトラス
An atlas of active enhancers across human cell types and tissues p455

Robin Andersson, Claudia Gebhard, Irene Miguel-Escalada, Ilka Hoof, Jette Bornholdt, Mette Boyd, Yun Chen, Xiaobei Zhao, Christian Schmidl, Takahiro Suzuki + et al.

Received 04 January 2013

Accepted 16 October 2013

Published online 26 March 2014

エンハンサーは、多細胞真核生物において、時間的、かつ細胞種特異的な遺伝子発現の活性化を正確に制御している。その特性や調節活性および標的を知ること は、分化と恒常性の調節を理解する上で、非常に重要である。本研究では、主要なヒトの組織と細胞種を網羅したFANTOM5パネルを用い、 in vivo で転写される活性化したエンハンサーのアトラスを作製した。我々は、エンハンサーには、CpGの少ないメッセンジャーRNAプロモーターと共通した特性が あるが、エンハンサーは両方向性でエキソソーム感受性の、スプライシングされない比較的短いRNAを産生しており、これらの産生がエンハンサー活性と強く 関連することを示す。このアトラスを用いて、さまざまな細胞間での調節プログラムをこれまでにない深度で比較し、疾患関連の調節性一塩基多型を同定し、細 胞タイプ特異的と普遍的なエンハンサーの分類を行った。さらに、エンハンサーが持つ冗長性の役割について探索したところ、この冗長性は発現パターンではな く、遺伝子発現の強さを説明するものだと分かった。オンラインで公開されたFANTOM5エンハンサーアトラスは、細胞種特異的なエンハンサーや遺伝子調 節について、独自の研究リソースを提供するものである。 

Enhancers control the correct temporal and cell-type-specific activation of gene expression in multicellular eukaryotes. Knowing their properties, regulatory activity and targets is crucial to understand the regulation of differentiation and homeostasis. Here we use the FANTOM5 panel of samples, covering the majority of human tissues and cell types, to produce an atlas of active, in vivo-transcribed enhancers. We show that enhancers share properties with CpG-poor messenger RNA promoters but produce bidirectional, exosome-sensitive, relatively short unspliced RNAs, the generation of which is strongly related to enhancer activity. The atlas is used to compare regulatory programs between different cells at unprecedented depth, to identify disease-associated regulatory single nucleotide polymorphisms, and to classify cell-type-specific and ubiquitous enhancers. We further explore the utility of enhancer redundancy, which explains gene expression strength rather than expression patterns. The online FANTOM5 enhancer atlas represents a unique resource for studies on cell-type-specific enhancers and gene regulation.

R-spondinと癌の続報は「さっぱり」である

R-spondinと癌の続報であるが、これが全く出てこないのである。約一年半になるが、なしのつぶて。これはさすがに怪しい。当初は10％に認めるといっておきながら、誰も追試できない（R-Spondinそのものは腸管stem cell等々でなかなかお盛んな遺伝子なので、興味をひいた研究者は多かったはずなのだが）。がっかりである。natureで追試できない一例であろう、おそらくね。

Nature (2012)

Received 23 December 2011

Accepted 06 June 2012

Published online 15 August 2012

Recurrent R-spondin fusions in colon cancer

Department of Molecular Biology, Genentech Inc

Somasekar Seshagiri, Eric W. Stawiski, Steffen Durinck, Zora Modrusan, Elaine E. Storm, Caitlin B. Conboy, Subhra Chaudhuri, Yinghui Guan, Vasantharajan Janakiraman, Bijay S. Jaiswal, Joseph Guillory, Connie Ha, Gerrit J. P. Dijkgraaf, Jeremy Stinson, Florian Gnad, Melanie A. Huntley, Jeremiah D. Degenhardt, Peter M. Haverty, Richard Bourgon, Weiru Wang, Hartmut, Koeppen, Robert Gentleman, Timothy K. Starr, Zemin Zhang, David A. Largaespada, Thomas D. Wu & Frederic J. de Sauvage

• Identifying and understanding changes in cancer genomes is essential for the development of targeted therapeutics¹. Here we analyse systematically more than 70 pairs of primary human colon tumours by applying next-generation sequencing to characterize their exomes, transcriptomes and copy-number alterations. We have identified 36,303 protein-altering somatic changes that include several new recurrent mutations in the Wnt pathway gene TCF7L2, chromatin-remodelling genes such as TET2 and TET3 and receptor tyrosine kinases including ERBB3. Our analysis for significantly mutated cancer genes identified 23 candidates, including the cell cycle checkpoint kinase ATM. Copy-number and RNA-seq data analysis identified amplifications and corresponding overexpression of IGF2 in a subset of colon tumours. Furthermore, using RNA-seq data we identified multiple fusion transcripts including recurrent gene fusions involving R-spondin family members RSPO2 and RSPO3 that together occur in 10% of colon tumours. The RSPO fusions were mutually exclusive with APC mutations, indicating that they probably have a role in the activation of Wnt signalling and tumorigenesis. Consistent with this we show that the RSPO fusion proteins were capable of potentiating Wnt signalling. The R-spondin gene fusions and several other gene mutations identified in this study provide new potential opportunities for therapeutic intervention in colon cancer.

子宮筋腫とMED12突然変異：続報（３）

この10年で一番驚いた報告の一つは子宮筋腫とMED12突然変異であった。通常このような論文はあとが続かないのだが、このテーマに関しては派手ではないが続報が続いている。良性腫瘍と突然変異でこれほど再現性のあるストーリーは他にはないと思われる。そこで面白いものをいくつか・・・

１）国立がん研究センターの金井さんのところから・・・・

1. 日本の子宮筋腫でも80%にMED12突然変異があるという報告。
2. 12例の平滑筋肉腫には2例しか認めない。
3.  興味深いのは
   
   「子宮外の平滑筋腫瘍には一切の MED12突然変異を認めない」ということ。
   
   小生は3年前からこのことがが知りたかった。

Histopathology. 2013 Mar;62(4):657-61.

Prevalence of MED12 mutations in uterine and extrauterine smooth muscle tumours

Akiko Matsubara, Shigeki Sekine, Masayuki Yoshida, Akihiko Yoshida, Hirokazu Taniguchi, Ryoji Kushima, Hitoshi Tsuda and Yae Kanai

Aims

To determine the prevalence of MED12 mutations in smooth muscle tumours of different organs.

Methods and results

A total of 142 smooth muscle tumours of the uterus, gastrointestinal tract, retroperitoneum and soft tissue were analysed for MED12 mutations using Sanger sequencing. Among the uterine tumours that were examined, MED12 mutations were identified in 36 of 45 conventional leiomyomas (80%), two of six cellular leiomyomas (33%), one of four bizarre leiomyomas (25%), none of four lipoleiomyomas (0%), and two of 12 leiomyosarcomas (17%). The two MED12-mutated leiomyosarcomas were associated with benign leiomyomatous components that also harboured MED12 mutations identical to those in the respective leiomyosarcomatous components. None of the extrauterine smooth muscle tumours, including the leiomyomas, leiomyosarcomas, and angioleiomyomas, had MED12 mutations.

Conclusions

Among uterine smooth muscle tumours, MED12 mutations are frequently present in conventional leiomyomas, but are significantly less common in histological variants of leiomyoma and leiomyosarcoma. In contrast to uterine lesions, none of the extrauterine smooth muscle tumours had MED12 mutations.

２）もうひとつ面白いのが子宮筋腫のin vitroモデルであり、これはドイツからの報告。 MED1２変異のある子宮筋腫細胞を培養系に移すと、変異細胞は直ちに消失してしまうというのだという。一パッセージも保たないのだという。面白いはなしだなあ。

Genes Chromosomes Cancer. 
2014 Apr;53(4):317-23. Jan 21.

Cell cultures in uterine leiomyomas: Rapid disappearance of cells carrying MED12 mutations.

Nadine Markowski D¹, Tadayyon M, Bartnitzke S, Belge G, Maria Helmke B, Bullerdiek J.
Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359, Bremen, Germany.

Abstract

Uterine leiomyomas (UL) are the most frequent symptomatic human tumors. Nevertheless, their molecular pathogenesis is not yet fully understood. To learn more about the biology of these common neoplasms and their response to treatment, cell cultures derived from UL are a frequently used model system, but until recently appropriate genetic markers confirming their origin from the tumor cell population were lacking for most UL, i.e., those not displaying karyotypic abnormalities. The identification of MED12 mutations in the majority of UL makes it possible to trace the tumor cell population during in vitro passaging in the absence of cytogenetic abnormalities. The present study is addressing the in vitro survival of cells carrying MED12 mutations and its association with karyotypic alterations. The results challenge numerous in vitro studies into the biology and behavior of leiomyomas. Cells of one genetic subtype of UL, i.e., those with rearrangements of the high mobility AT-hook 2 protein gene (HMGA2), seem to be able to proliferate in vitro for many passages whereas tumor cells from the much more frequent MED12-mutated lesions barely survive even the first passages. Apparently, for the most frequent type of human UL no good in vitro model seems to exist because cells do not survive culturing. On the other hand, this inability may point to an Achilles' heel of this type of UL.

食道扁平上皮癌：ゲノム解析p53はやはり最強

Nature(2014)

Received 20 May 2013 
Accepted 25 February 2014 
Published online 16 March 2014 

Identification of genomic alterations in oesophageal squamous cell cancer 

Yongmei Song,Lin Li, et al. 

Oesophageal cancer is one of the most aggressive cancers and is the sixth leading cause of cancer death worldwide1. Approximately 70% of global oesophageal cancer cases occur in China, with oesophageal
squamous cell carcinoma (ESCC) being the histopathological form in the vast majority of cases (>90%). Currently, there are limited clinical approaches for the early diagnosis and treatment of ESCC, resulting in a 10% five-year survival rate for patients. However, the full repertoire of genomic events leading to the pathogenesis of ESCC remains unclear. 

Here we describe a comprehensive genomic analysis of 158 ESCC cases, as part of the International Cancer Genome Consortium research project. We conducted whole-genome sequencing in 17 ESCC cases and whole-exome sequencing in 71 cases, of which 53 cases, plus an additional 70 ESCC cases not used in the whole-genome and whole-exome sequencing, were subjected to array comparative genomic hybridization analysis.

We identified eight significantly mutated genes, of which six are well known tumour associated genes (TP53, RB1,CDKN2A, PIK3CA,NOTCH1, NFE2L2), and two have not previously been described in ESCC (ADAM29 and FAM135B). Notably,FAM135B is identified as a novel cancer implicated gene as assayed for its ability to promote malignancy of ESCC cells. 

Additionally, MIR548K, a microRNA encoded in the amplified 11q13.3-13.4 region, is characterized as a novel oncogene, and functional assays demonstrate that MIR548K enhances malignant phenotypes of ESCC cells.

Moreover, we have found that several important histone regulator genes (MLL2 (also called KMT2D), ASH1L, MLL3 (KMT2C),SETD1B,CREBBP andEP300) are frequently altered in ESCC. 

Pathway assessment reveals that somatic aberrations are mainly involved in the Wnt, cell cycle and Notch pathways. Genomic analyses suggest that ESCCand head and neck squamous cell carcinoma share some common pathogenic mechanisms, and ESCC development is associated with alcohol drinking. This study has explored novel biological markers and tumorigenic pathways that would greatly improve therapeutic strategies for ESCC.

 p53の変異率83%にはただただ驚くばかりである。その他はすでに知られている遺伝子変異が多い。

ここまで解析してあると、予後予測が知りたくなる。そんな遺伝子はないのか？

この論文ではFAM135Bが予後関連遺伝子としてあげられている。

カプランマイヤーを見せられたら、当然次は多変量解析がみたい。 

確かにまあまあである。多変量でこのp値なら
「なにかに」引っ張られているということなのかね。
この6例の変異症例に

臨床的特徴があるのかないのか？

さてさて・・・・

最後はパスウェイ解析である。p53が第一ヒットとして、次の変異は結構多彩（？）になるのか、少なくとも各種遺伝子の変異頻度はそこまで高くない。

食道扁平上皮癌のゲノム構造も近年、次第に共通のlandscapeが見えてきたというところである。

さて胃癌はどうなっているのだろう？

2N chimeraの謎

小保方さんの実験に関しては様々な疑義と幅広い意見が広がっている。「小保方さん頑張って」というノートを書いた翌日に理研のプロトコールが発表されSTAP  stem cellにはTCRの再構成がなかったこと（8クローン中8クローン）が公表された。見た瞬間「脱力した」というのが正直なところであるが、いろんなご意見をネットで拝見していくうちに、「脱力した」ことが正しかったのかわからなくなる。

小生はあくまで STAP細胞というものが存在する可能性があると（今に至るも）考えている。

確かに論文構成は言われるとおりなら、こんなにひどいものはない。本日の理研の説明ではTcellの由来は脾臓ではなく骨髄なのだそうだ。これなら学位論文骨髄由来の写真が流用されたと広く報道されたのもfakeではなくなる。なくなるが、余りに杜撰なnature論文である。このように小保方さん論文にはかなりの「いらだち」を感じ始めている今日この頃なのだが、それでも彼女が見つけたという現象には惹かれ続けている。

１）初期のSTAP細胞の中には確かにT-cell由来のものが存在する可能性はいまだに否定されていないのではないだろうか？
２）”STAP  stem cell”に育ちあがるクローンはT-cell由来ではなかった。これは正しいのかもしれない。TCR再構成が認められないのだから。
３） STAP細胞のソースは何なのだろう？

1. 分化したT細胞か？
2. T細胞以外の分化細胞か？
3. 間質に混じる未分化細胞か？
4. あるいは様々な背景（もちろんここにはfakeもあるわけだが）から混入したES細胞か？

この二週間くらい事態の推移を見ていて、これはやはり混入した未分化細胞を拾っているなと思い始めていた。世の中にはSTAPがES細胞の混入という説明もある。しかし若山先生が説明されたように、

1. ESなら酵素処理して単細胞にして胚盤胞に入れてもマウスに育ちあがるが
2. この「STAP細胞」は細胞塊を酵素処理するとうまく育たない、microdissectionが必要である
3. 若山先生にとっても 「STAP細胞」が「ES」 である可能性と戦いながらの実験であったはず 

 以上の説明からESではないのではないかと思う。

ところで本日の理研の発表資料の中には「さらなる謎」が含まれていた。

二枚の写真であり、Fig 1i のゲノムPCRの原図である。lane３は世評どおり切り貼りであった。拡大したり加工もされているようだが、これは許容範囲であろう（本当はダメよ！よい子の皆さんは真似しちゃダメです）。小生が興味をもったのは二枚目の写真の右側にある 2N chimera（CD45  STAP cell）というレーンである。再構成しているのである。しかも通常のラダーよりも数が少ない（？？）。これはいったいなんのDNAなのですか？マウスのDNAではないの？？

こんな悩ましいデータを晒されたら、また混乱してしまう。でもね、これから類推するに、主任実験者たちはマウスのゲノム解析もしっかりやっているのではないかしら。論文が発表された瞬間から世間が望んでいたマウスのゲノム解析である。

存在するならデータを出してくださいな。

追記：その後貴重なコメントを頂きました。

2 件のコメント:

匿名 さんのコメント...

いつも勉強させてもらってます。
Articleのmethodには以下の記述があってchimera mouseの解析をやっていると書いてあるのですが、なぜかその結果を示すデータも記述もありません。

TCR-β chain gene rearrangement analysis
Genomic DNA was extracted from STAP cells and tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells. PCR was
performed with 50 ng DNA using the following primers,,,

この電気泳動で示されているのがもし2N chimeraの解析結果だとすると、なぜ著者たちはこのデータを論文に使わなかったのでしょうか？謎ですね。

2014年3月15日 20:36

Epistasis さんのコメント...

コメントありがとうございました。

早速論文を見直してみましたが、仰せの通り書いてありますね。

これには驚いた。確かにキメラマウスのtailのDNAのようですね。

なぜ使わなかったのでしょう？

自分たちの実験の正当性を担保する強力で貴重なデータであったかもしれないのに、もう少しこだわれよ、といいたい。

それとも2Nキメラマウス組織にもある割合で血球細胞（非STAP由来のT-cell）が混じっているはずだけど、これをPCRで拾ったと解釈せざるを得なかったのかな。

Material & methodで述べておきながら、結果データは載せていないというのもひどい話ですね。

小保方さん、頑張って・・

小保方さん、頑張ってください。今が一番大変な時でしょうが、私は貴方の実験系が再現性をもって再び世の中に受け入れられる日が近いうちにやってくることを祈っています。

再現性がないと言っている世界中の実験者は、必ずしも小保方さんがお使いのシステム（動物ー細胞）系を使っていないと聞いています。Oct (promotor-蛍光）がtransgeneとして入っているマウスであり、なおかつ小保方さんと共通のものを使えば、そのうち再現できる研究者が出てくる可能性があると思います。若山さんが90年台にハワイの柳町教授のところであのマウスを作ったときも、当初は300回に一回くらいしか成功しなかったと書かれています。小保方さんはこれまで毎回上手くいっていたので、他人がなぜ上手くいかないのかわからないのが現状かもしれぬ。あるいは小保方さんご自身も現状上手くいっていないのかもしれぬ。でも時間がたてば、どこからか上手くいくようになる（こともあるのが、このようなの実験ではよくあることではないだろうか）。

将来、最初に上手くいったヒトはこれは慎重にならざるをえません。自信をもって世間に公表するには、再現につぐ再現、時には人の手を借りた再現（デニソワ人やネアンデルタール人のゲノム解析をやったペーボ（Svante Pääbo）のように）をやった後に、世間に再び現れてくることになるのかもしれない。

小保方さんの実験がfakeとはとても小生には思えないのです。意図的なfakeならいったいどのような技で笹井、若山さんらを目くらますことができるのだろう？そもそも当初は誰も信じてくれなかった実験系なのだしハードルは一層高かったはずです。

実験に紛れ込んでくるartifactについては、意地が悪いくらいの突っ込みがあったはずです。特に細胞のソース。当初疑惑の目で見ていたプロ中のプロを納得させるということが、いかに大変なことだったのか想像にあまりあるのです。

一方で生まれてくるマウスのゲノム解析は、既存のパラダイムであれば決定的な証拠になると思うので、ぜひデータを示して頂きたいと思いますが・・・

しかしこれとて最近では、

iPS化を通すとゲノム修復すらありうるという論文があります

2014年1月13日月曜日

Ring chromosomeと山中iPSによる自己修復: nature

あ、これ対側ゲノムが再構成を起こしていないという前提であり、なおかつ iPS化の実験では染色体のリング化という特殊な状況があったという前提もあるわけですが・・・

reprograming胎生早期にゲノム修復が起こるのならばoff spring mouseにゲノム変異が残らないという可能性もあるかもしれないと、余計な妄想を抱いてしまう。

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再現性が待たれます。小生はいつまでも待ちたい。小保方氏としては、あるいは他のラボと共同すること、御本人が知っているコツを教示すること、御本人も気が付いていないコツ（ピットホール）を皆で見出すこと。

自信を持って先に進まれたら良いと思う。それくらい夢のある実験だと思う。思いたい。

誰かが言っておられたけど、fakeなら自然に消えていくだけです。しかし私は自らが敢えて火消しに回りたくない。黙ってしばらく待つのみです。