SARS-CoV-2の中和もできますよ・・・というものであった。多少の変異が将来生じても力価は衰えない可能性をうたっていた。
Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells
さて5月17日のCellには「今回のCOVID-19回復期患者から中和抗体を作成した」という報告が出た。今年の二月に北京の病院で回復期にあった患者60人を解析し、14個のヒト型モノクローナル抗体を得ている。最有力の中和抗体（BD-368-2)のIC50はSARS-CoV-2のpseudovirus相手だと1.2ng/mlであり、（本物の）SARS-CoV-2相手でも15ng/mlである。
方法論は洗練されすぎていてちょっとついていけないが、だいたいならわかる。単一B細胞を濃縮しVDJシークエンシングしたものをベクターを介してヒトの抗体産生系に移行しモノクローナル・ヒト抗体を樹立するというものだ。後半の方法論はわかるが、前半のスクリーニング方法がちと分かりづらい。
最近好みの全訳を載せてみる。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）と命名された新規コロナウイルスによるコロナウイルス疾患2019（COVID-19）は、重篤なパンデミックとして世界的に流行している。（Callaway et al. SARS-CoV-2およびSARS-CoVはいずれもbetacoronavirus属のB系統に属し（Zhouら、2020年、Wuら、2020年）、それらのRNAゲノムは約82％の同一性を共有している（Chanら、2020年）。SARS-CoV-2が標的細胞に感染するメカニズムは、よく研究されており、最近報告されている（Hoffmannら、2020年、Wallsら、2020年）。SARS-CoVと同様に、SARS-CoV-2の表面上のスパイク（S）糖タンパク質は、ウイルスの膜融合および受容体認識を媒介する（Wallsら、2020年）。Ｎ末端領域のＳ１サブユニットは、ウイルスの付着に責任があり、宿主細胞上のＡＣＥ２受容体に直接結合する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。現在のところ、COVID-19については、ウイルス標的相互作用に対する有効な治療法は存在しない。
適応免疫応答によって産生された中和抗体を含む完治患者の血漿は、治療的モダリティとして使用された場合、軽度および重度のCOVID-19患者の両方の明らかな臨床的改善をもたらしている（Chenら、2020年、Shenら、2020年、Cao、2020年）。しかしながら、血漿を大規模に生産することができないため、治療的使用は限定的である。一方、回復期患者の記憶Ｂ細胞から単離された中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、そのスケーラビリティおよび治療効果のために、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ-２に対する有望な介入として機能する可能性がある。ウイルス表面タンパク質を標的とするヒト由来のmAbsは、HIV、エボラ、および中東呼吸器症候群（MERS）などの感染症に対する治療および予防効果をますます示している（Cortiら、2016、Wangら、2018、Scheidら、2009）。患者におけるそれらの安全性および効力は、複数の臨床試験において実証されている（Xuら、2019年、Caskeyら、2017年）。それらの利点にもかかわらず、ヒトメモリB細胞からの強力な中和mAbsのスクリーニングは、多くの場合、遅くて手間のかかるプロセスであり、これは、世界的な健康緊急事態に対応する場合には理想的ではない。SARS-CoV-2中和性mAbsをスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法が緊急に必要とされている。
VDJの組換えおよび体性超変異により、B細胞は多様なB細胞レパートリーを示すため、一度に1つのB細胞を分析する必要がある（Bassingら、2002年）。記憶Ｂ細胞の単細胞クローン増幅などの技術は、通常、mAbsを生成するために異種Ｂ細胞集団からペアの免疫グロブリン重軽鎖ＲＮＡ配列を得るために利用される（El Debsら、2012年、Niuら、2019年）。回復期患者からのエプスタインバーウイルス（EBV）不死化メモリB細胞のクローナル増幅は、HIV、デング熱、およびMERSなどのウイルス感染症に対する中和mAbsの単離に成功していることが証明されている（Scheidら、2009年、Burtonら、2009年、Cortiら、2015年）。しかし、時間のかかるインキュベーションおよびスクリーニングのステップのため、この技術は、成功したスクリーニングを完了するまでに少なくとも数ヶ月を要する。
一方、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）またはＢｅａｃｏｎ（Ｂｅｒｃｋｌｅｙ Ｌｉｇｈｔ）のようなオプトフルイディクスプラットフォームと組み合わせた単細胞ＲＴ-ＰＣＲは、単細胞ソーティング後の単一抗原結合メモリＢ細胞上で入れ子状ＰＣＲを行うことにより、数日で抗体配列を得ることができた（Ｔｉｌｌｅｒら、２００８年、Ｗａｒｄｅｍａｎら、２００３年；Ｗｒａｍｍｍｅｒｔら、２００８年；Ｌｉａｏら、２００９年）。この方法は、ＨＩＶおよびＭＥＲＳを含む様々な感染症における中和性ＭＡＢの効率的な単離につながっている（Ｓｃｈｉｄら、２００９年、Ｗａｎｇら、２０１８年）。それにもかかわらず、最近開発された10Xクロムを用いたB細胞受容体レパートリーのハイスループットシングルセルRNAおよびVDJシークエンシングは、B細胞スクリーニングスループットの点でシングルセルRT-PCRを凌駕している(Goldsteinら、2019年、Hornsら、2020年)。マイクロ流体ベースの手法は、1回の実行で数万個の単細胞B細胞からオートペアされた重鎖および軽鎖配列を得ることができ、HIVに対するヒト中和性mAbsの単離に成功している(Setliffら、2019)。
ここでは、回復期のCOVID-19患者からの抗原結合B細胞のハイスループットシングルセルRNAおよびVDJシークエンシングによって達成されたSARS-CoV-2中和抗体の迅速かつ効率的な同定を報告する。免疫グロブリンG1（IgG1）抗体を発現する8,500以上の抗原結合B細胞のクローンタイプが60人の回復期患者から同定された。その結果，14種類の強力な中和性mAbを同定し，その中で最も強力なmAbであるBD-368-2は，偽型および真正のSARS-CoV-2に対して1.2および15 ng/mLのIC50を示した．さらに、in vivo実験では、hACE2トランスジェニックマウスモデルを用いて、BD-368-2がSARS-CoV-2に対して強力な治療効果と予防的保護を提供できることが確認された（Baoら、2020、Yangら、2007、McCrayら、2007）。
さらに、SARS-CoV-2スパイクエクトドメイン三量体との複合体である中和性mAb BD-23の低温電子顕微鏡構造を解析し、そのエピトープがRBD/ACE2結合モチーフと重複していることを明らかにした。さらに、SARS-CoV-2とSARS-CoVの高い保存性に基づき、SARS-CoV中和抗体m396とCDR3Hの構造が類似していることを利用して、SARS-CoV-2に対する強力な中和mAbsが大規模な抗原結合クローンライブラリーから直接選択できることを示した（Prabakaranら、2006; Zhuら、2007）。以上の結果から、ハイスループットな単細胞シークエンシングにより、強力な治療・予防効果を有する中和抗体の同定が可能であることが示され、COVID-19のような流行・新興感染症への介入に大きく貢献できる可能性が示唆された。
結果
完治期患者の単一B細胞のハイスループットシークエンス
従来の方法とは異なり、ハイスループットscVDJシーケンシング（scVDJ-seq）から得られた大規模なデータにより、インビトロ抗体発現に先立ってB細胞のクローンタイプの濃縮度を調べることが可能になった（Goldsteinら、2019年、Crooteら、2018年）。重鎖および軽鎖の両方について同一のCDR3領域を共有するB細胞を同一のクローンタイプにグループ化し、それらの濃縮度を、そのクローンタイプについて観察された細胞数に基づいて計算した。抗原活性化B細胞は、既存のナイーブB細胞およびメモリーB細胞からクローン選択および拡張を経て進むので（Muruganら、2018年、SeifertおよびKü ppers、2016年）、我々は、濃縮されたB細胞のクローンタイプが、高親和性SARS-CoV-2結合抗体および中和抗体を産生する可能性が高いという仮説を立てた。
この仮説を利用するために、まず、末梢血単核細胞（PBMC）を採取し、北京陽安病院のCOVID-19回復期患者12人からB細胞を単離した（表S1）。新鮮に単離したＢ細胞またはＣＤ２７＋メモリーＢ細胞サブセットについて、１０Ｘクロム５′ｍＲＮＡおよびＶＤＪシークエンシングを用いて、小条件ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）およびｓｃＶＤＪシークエンシングを行った（図１ＡおよびＳ１Ａ）。scVDJデータは、確かに濃縮されたIgG1クローンタイプを明らかにし（図S1FおよびS1H）、CD27+メモリーB細胞の選択は、発見されたIgG1クローンタイプ（図S1GおよびS1I）と同様に、シーケンシングされたメモリーB細胞の数（図S1DおよびS1E）を大きく改善した。しかしながら、濃縮されたIgG1+クローンタイプを含むメモリB細胞から選択された130のin vitro発現mAbs（表S2）から、BD-23と名付けられた2つのRBD結合mAbsのうちの1つだけが、偽型および真正のSARS-CoV-2に対して弱いウイルス中和能力を示した（図S1BおよびS1C）。RBD結合性mAbsと中和性mAbsの同定の効率が低いため、抗原親和性に基づいた選択が必要であり、スパイク/RBD結合性B細胞を大幅に富化させることができる。
抗原結合性単細胞B細胞のハイスループットシークエンシングによる中和性mAbsの効率的同定
RBD結合B細胞を濃縮するために、我々は磁気ビーズ分離（図1A）を介して抗原結合B細胞を選択するためにビオチン化されたRBDとSタンパク質の両方を利用した。選択は、B細胞の数の大きな減少を導入するので、十分な10倍負荷のために異なる患者からのPBMCを組み合わせた。合計で、６０人の回復期患者の抗原結合Ｂ細胞を６つの異なるバッチで分析した（表Ｓ１）。目標は中和性mAbsを産生することであったので、重軽鎖対にまたがる生産的なV-Jを持つことができなかったすべてのB細胞をフィルタリングした。合計8,558個の異なるIgG1提示抗原結合クローンタイプが検出された（表1）。さらに、scRNA-seqデータは、メモリB細胞の同定のためのmRNA発現に基づいた細胞タイピングを行うことを可能にした（図1BおよびS2）。ナイーブB細胞とメモリーB細胞の間には十分な分離が見られ、また、非B細胞とメモリーB細胞の間にも十分な分離が見られた。しかしながら、スイッチされた／スイッチされていないメモリＢ細胞と疲弊したメモリＢ細胞との間の明確な分離は、いくつかのバッチでは観察されないかもしれないが、これは主に、配列決定の深さが比較的低いことと、ｓｃＲＮＡ配列決定の細胞あたりに検出される遺伝子の数が少ないことに起因する（表Ｓ３）。
各シーケンシングバッチの実験詳細
エンリッチメント抗原とは、MACSプルダウンに使用した抗原を指す。バッチ4は、RBD結合B細胞をろ過したサンプルで実施した。PBMCステータスとは、使用したPBMCが以前に凍結されていたかどうかを指します。VJペアの細胞とは、完全長重鎖および軽鎖可変領域の両方が検出された細胞を指します。細胞は、それらが同一の重鎖および軽鎖CDR3 DNA配列を有する場合、同じクローンタイプに割り当てられます。図S2も参照のこと。
エンリッチメント抗原とは、MACSプルダウンに使用した抗原を指す。バッチ4は、RBD結合B細胞をろ過したサンプルで実施した。PBMCステータスとは、使用したPBMCが以前に凍結されていたかどうかを指します。VJペアの細胞とは、完全長重鎖および軽鎖可変領域の両方が検出された細胞を指します。細胞は、それらが同一の重鎖および軽鎖CDR3 DNA配列を有する場合、同じクローンタイプに割り当てられます。図S2も参照のこと。
中和性mAbsの同定の効率を高めるために、中和性mAbsを産生する可能性が低いクローンタイプをフィルタリングするための一連の基準を開発した（図1D）。第一に、IgG1-発現B細胞がウイルス刺激に強く反応するので、IgG1-発現B細胞を含む濃縮されたクローンタイプのみを選択した（図1CおよびS3A）（Vidarssonら、2014）。第二に、IgG2-発現B細胞は通常、ウイルス性病原体に対して弱く反応するため、IgG2-発現クローンタイプは理想的な候補として含まれなかった（Iraniら、2015）。次に、2％よりも高い体細胞性超変異率（SHM）を有するB細胞を含まないクローンタイプは、不十分な親和性成熟を示し、除外された（Crooteら、2018; Methorら、2017）。最後に、疲弊した記憶Ｂ細胞およびナイーブＢ細胞は抗原刺激に対してより効果的に反応しないので（Moir and Fauci, 2014）、疲弊した記憶Ｂ細胞またはナイーブＢ細胞のみを含むクローンタイプは、理想的な候補として考慮されなかった（図１ＢおよびＳ２）。これらを合わせると、濃縮されたクローンタイプから合計169個の理想的な候補が選択され、トランスフェクションによりHEK293細胞で発現された（表S2）。一方、47個の非理想的な候補もまた、我々の選択基準の有効性を検証するための参考としてin vitroで発現させた（表S2）。
精製したmAbsをELISAおよび表面プラズモン共鳴（SPR）によりSARS-CoV-2 RBD/スパイク反応性を調べたところ，149種類のS結合性mAbsが同定され，そのうち半数以上がRBDに結合していた．さらに，SARS-CoV-2シュードウイルスシステムを用いて，ELISA陽性の全mAbsの中和能を調べた．我々は、RBD結合性mAbsのみがシュードウイルス中和効果を示し（図1E）、KdがACE2/RBDの解離定数（15.9 nM）より小さいかそれに近いRBDに結合したmAbsのみが（図S5B）、SARS-CoV-2シュードウイルスに対して有意な中和効果（IC50 < 3 μg/mL）を有することを発見した（図S4AおよびS4B）。完全長Sタンパク質とRBDタンパク質の両方がRBD結合mAbsを濃縮することができますが、異なる効率で（図1F）。RBDタンパク質を濃縮抗原として使用した場合、Sタンパク質を使用した場合と比較して3倍のRBD ELISA陽性率が得られた。最も重要なことは、理想的な候補から選択されたmAbsは、強力なRBD結合性mAbs（Kd < 20 nM）およびSARS-CoV-2中和性mAbsの同定において、それぞれ46％および25％の効率を示したことである（図S3D）、これは非理想的なmAbs候補と比較して有意に高い（図S3BおよびS3C）。
SARS-CoV-2に対する高い中和力を有する濃縮クローンタイプのmAbsの開発
濃縮されたクローンタイプから分離された中和性mAbのうち，7種類のmAbはSARS-CoV-2偽ウイルスに対してIC50が0.05 μg/mL以下で強力な中和能を示した（図2Aおよび2C）．最も強力なmAbであるBD-368-2は，BD-368と同じクローンタイプから選択されたものであり（図1C），IC50は1.2 ng/mLであった．7 種類の mAb はいずれも RBD に nM またはサブ nM の Kd で強く結合しており（図 S5A）、ACE2 と RBD との結合を競合的に阻害していた（図 5C および 5D）。本物のウイルスに対するそれらの中和の可能性を評価するために、我々は、COVID-19患者から分離された本物のSARS-CoV-2を使用して、プラーク低減中和試験（PRNT）を実施した。試験したすべてのmAbsの中で、BD-368-2は15 ng/mLのIC50を持つ真正ウイルスに対して最も高い効力を示した（図2Bおよび2C）。PRNTによって示された本物のウイルスの中和をさらに検証するために、我々は、本物のSARS-CoV-2に対してBD-218を使用して細胞病理学的効果（CPE）阻害アッセイを行った。BD-218は、1.2μg/mLの濃度で、3つのレプリケートすべてにおいて完全なウイルス阻害を示した（図S6AおよびS6B）、PRNTの結果と一致した。これらのデータは、抗原結合B細胞のハイスループットな単細胞シークエンシングによって、回復期の患者から非常に強力な中和性mAbsが同定され得ることを示している。
BD-368-2はhACE2マウスにおいて高い治療効果と予防効果を示した
特定された中和mAbsが、in vivoでSARS-CoV-2に対する治療的介入および予防的保護として機能し得るかどうかを評価するために、SARS-CoV-2に感染したhACE2トランスジェニックマウス（Baoら、2020年）において、BD-368-2の中和効果を試験した。BD-368-2は、偽型および本物のSARS-CoV-2の両方に対して最高の効力を示すので、選択された。合計９匹のｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを本研究で使用し、３つのグループ（Ｎ＝３）に等しく分割した。ウイルス感染の24時間前に、hACE2トランスジェニックマウスにBD-368-2を20mg/kg（マウスの体重に対して）腹腔内注射することで予防効果を調べた（図3A）。治療群では、感染の2時間後に20mg/kgのBD-368-2を注射した。陰性対照として、H7N9ウイルスに対するIgG1抗体である20mg/kg HG1Kを感染の2時間後に注射した。感染後5日間、各マウスの体重を毎日記録したところ（図3A）、治療群と予防群では体重が維持されていたのに対し、陰性対照群では有意に体重が減少していた（図3B）。このことから、感染前後にBD-368-2を投与することで、SARS-CoV-2感染マウスの生理状態を大幅に改善することが可能であることが示唆された。さらに、5dpiでの肺のqRT-PCRによるウイルス負荷を解析したところ（Yang et al. さらに、感染後 2 時間後に BD-368-2 を投与すると、マウス肺におけるウイルスコピーが 3～4 log 減少し、SARS-CoV-2 の複製を効果的に抑制できることを示した（図 3C）。以上のことから，BD-368-2 は生体内で高い治療効果と予防効果を示した。
三量体スパイク蛋白質に結合した中和性mAbの低温電子顕微鏡構造
SARS-CoV-2に対する中和性mAbsは，濃縮されたクローンタイプを解析した結果，効率的に同定された．しかし、各患者のB細胞のサンプリングが浅かったため、大部分のクローンタイプは濃縮されていなかった。しかしながら，非濃縮抗原結合性クローノタイプは，今後の中和性mAbの同定のための貴重なライブラリーとして残っている．恣意的な選択は、弱い抗原結合性mAbsの割合が高くなる可能性があり、また、抗原のプルダウン中に非特異的に結合する傾向があるため、非濃縮化クローンタイプのための新しい抗体選択基準が必要である。以前、人々は、より良いmAbs選択のためにIg-seqデータをアノテーションするために抗体構造予測を使用してきた（DeKoskyら、2016）。リファレンス中和mAbsと類似のCDR3H構造を共有するmAbsを選択することにより、構造アノテーションアプローチは、Ig-seqの性能を向上させるだけでなく、in vitro抗体の成熟化にも成功していることが証明されている（Kovaltsukら、2017年、Krawczykら、2014年、Sela-Culangら、2014年）。これらの結果に触発されて、CDR3Hに基づく構造予測は、回復期患者からのscVDJ-seqデータのアノテーションにも役立ち、それがSARS-CoV-2に対する中和mAbsの同定の効率を向上させるのに役立つかもしれないという仮説を立てた。
しかし、主な難点は、参照抗体構造の選択にある。現在までのところ、SARS-CoV-2中和用mAbの構造はProtein Database（PDB）に記録されておらず、これが参考となる可能性があります。この問題に対処するために、我々は、BD23-FabのS字型エクトドメイン三量体との複合体の低温電子顕微鏡構造を3.8Åの分解能で解いた（図4AおよびS7、表S4）。ここでは、Sエクトドメインは、以前に報告されているように非対称な構造を採用しています（Wrappら、2020）、1つのプロトマー（mol A）のRBDは "上 "の位置を採用し、他の2つのRBD（mol BおよびC）は "下 "の位置を採用しています。この3D再構成では、単一のBD23-Fabは、S三量体ごとに観察され、それは原形質Bの "ダウン "のRBDを結合しています。現在の分解能では、BD23-FabとRBDの間の分子間相互作用の詳細な解析をサポートしていませんが、BD23のエピトープは、ACE2が認識しているモチーフと重複していることが明らかになっています。実際、RBDとACE2の複合体構造を比較すると、BD23-FabはACE2と競合してRBDに結合していることが明らかになった（図4C）。この観察は、BD-23のSARS-CoV-2中和能力がACE2-RBD結合の破壊に由来することを示唆しており、これは、以前に同定されたSARS-CoVに対する中和mAbsと非常に類似している(Prabakaranら、2006; Yuanら、2020)。実際、いくつかの研究は、SARS-CoV中和mAbsがSARS-CoV-2を交差中和し得ることを示唆しており（Wangaら、2020年；Tianら、2020年、Lvら、2020年）、これは、SARS-CoVとSARS-CoV-2のRBDの間の類似性をさらに強調している。全体として、構造観察およびSARS-CoVとSARS-CoV-2の間の高い保存性は、SARS-CoV中和性mAbsの結晶構造を参考にして、類似のCDR3H構造を共有するSARS-CoV-2抗原結合クローンタイプをスクリーニングして中和性mAbsを同定することも可能であることを示唆している。
CDR3Hの構造類似性に基づく強力な中和性mAbsの選択
CDR3Hに基づいて予測されたIgG1-presenting clonotypeの構造をFREADを用いて、PDBデータベースに登録されているSARS-CoV中和用mAbsの結晶構造とBD-23の構造を比較した。残念ながら、BD-23と高いCDR3H構造類似性を示すIgG1を提示するクローンタイプはなかった。しかしながら、合計12個のIgG1クローンタイプは、PDB ID 2dd8および2ghw（表S2；図5C）と高い構造類似性を示し、これらはそれぞれ、以前に単離されたSARS-CoV中和mAbs m396および80Rに対応する（Prabakaran et al. 今回同定されたmAbsのCDR3H配列はm396（2dd8）と高い相同性を有しており（図5A）、ACE2/RBD結合を阻害することでSARS-CoVを中和する（図5D）。
驚くべきことに、12種類のmAbsのうち7種類のmAbsが強いRBD結合親和性を示し、偽型SARS-CoV-2に対して強力な中和能を示すことがわかった（図5Bおよび5C）。また，BD-503，BD-508，BD-515の3つの代表的なmAbsについても，真正のSARS-CoV-2に対する中和力をPRNTで確認し，高い中和力を示した（図5E，5F）．さらに、これらのmAbsは、重鎖にはVH3-66/JH6またはVH3-53/JH6遺伝子セグメント、軽鎖にはVLK1-9またはVLK1D-33/39遺伝子セグメントによって大部分がコードされていた（図5C）。アミノ酸配列とVDJの組み合わせが類似していることから、これらのmAbsが同じ系統に由来するかどうかを疑問視した。RNA変異解析の後、我々は、これらのmAbsのどれもが同じ系統に由来するものではなく、同じ患者に由来するものではないことを発見した。これらの観察を合わせると、特定のSARS-CoV-2エピトープに結合するステレオタイプのB細胞受容体が、HIV、インフルエンザ、およびC型肝炎で観察されてきたものと同様に、異なる個体に存在する可能性があることが示唆される（Gornyら、2009年、Ekiertら、2009年、Marascaら、2001年）。実際、二重抗体サンドイッチELISAを用いたエピトープビニング実験により、BD-503、BD-508、およびBD-515はエピトープが重複している可能性が高いことが示されている（図6）。しかし、これらのエピトープが大きく保存されているかどうかを確認するためには、正確なエピトープを得るためには、より多くの構造解析が必要である。
議論
新しい中和性 mAbs の発見効率を向上させるために、in vitro 発現前の抗体提示 B 細胞の系統解析を適用した。scRNA と scVDJ シーケンシングから得られる大規模な単細胞分解能データは、ハイブリドーマや単細胞 RT-PCR ベースの技術では容易には達成できない系統解析を行う機会を与えてくれた。各クローンタイプの濃縮度数を計算できることは、自然なクローン的に拡張されたB細胞系統の優先的な選択を可能にするだけでなく、抗原濃縮ステップ中の非特異的抗原結合の偽陽性率を減少させることにもつながる（図1A）。単一細胞レベルでのmRNA発現の同時測定は、さらに個々のB細胞の細胞タイピングを可能にし、これは疲弊したナイーブなB細胞サブセットを除去するために重要である。しかし、現在の浅いscRNAシーケンスでは、疲弊したメモリB細胞と非疲弊したメモリB細胞を正確に分離することはほとんどできない。したがって、中和性mAbsの同定を改善するために、排出されたメモリB細胞を除去することの有効性をさらに評価するためには、scRNAライブラリのより深い配列決定が必要である。
クローン的に濃縮されたB細胞のクローンタイプの他に、配列決定されたB細胞の大部分は、本研究では利用されなかったが、潜在的な中和性mAbsの貴重なライブラリとして残った。それにもかかわらず、濃縮されていないため、濃縮されていないB細胞の大規模なプールからmAbsを選択することが問題となっていた。そこで我々は、CDR3H構造予測などのバイオインフォマティクスに基づいた選択アプローチを利用した。SARS-CoV中和抗体m396とCDR3H構造が非常に類似しているmAbsは、SARS-CoV-2に対して驚くほど高い中和力を示した。VDJ遺伝子セグメントの大部分が保存されており、これらのmAbsのエピトープが重複している可能性が高いことから、SARS-CoV-2に対するステレオタイプのB細胞受容体が存在することが示唆された。異なる個体からVH3-66/JH6またはVH3-53/JH6をコードする重鎖に基づいて選択されたmAbsの予備的研究は、実際に高力価のSARS-CoV-2中和mAbsの高い割合を明らかにし（データは示されていない）、SARS-CoV-2に対するステレオタイプのB細胞受容体が存在することを支持する。
72個のS1/S2（非RBD）結合mAbsが同定されたが、いずれもシュードウイルス中和能力を示さなかった。非RBD結合性中和mAbsがMERS-CoVに対して観察されたので、これは興味深い結果であった（Xuら、2019）。抗原の異なる領域を標的とする抗原結合B細胞クローンタイプの残りのプールからのより多くの抗体は、観察をさらに確認するために、中和能力についてスクリーニングされるであろう。さらに、疑似ウイルスのより多くの株を利用して、ウイルス変異後の、特にＲＢＤ領域における中和脱出の潜在的なリスクを調べることができる（Wangら、2018）。ウイルス変異に対する可能性のある解決策は、2つの異なるエピトープを標的とする2つの強力なmAbsを組み合わせることである可能性がある。エピトープビニングの結果（図6）は、BD-368-2と同じエピトープを共有するBD-368が、ほとんどの強力な中和mAbsで非重複エピトープを示すことを示唆した。BD-368-2 と他の中和性 mAb を組み合わせた抗体カクテルは，SARS-CoV-2 の中和力を個々の mAb と比較して大幅に向上させることができ，また，両方のエピトープに変異が現れる可能性が低いため，突然変異の逃避を大幅に防ぐことができると考えられた．
世界的なパンデミックとしてのCOVID-19の継続的な普及は、SARS-CoV-2感染症に対する効果的な介入を必要としている。我々が同定した強力な中和抗体は、hACE2 トランスジェニックマウスを用いた結果からも明らかなように、有効な治療法および予防法を提供する可能性がある。現在、BD-368-2を用いた臨床試験が進行中である。本研究で得られたハイスループットシングルセルシーケンシング法の応用は、COVID-19以外の感染症への応用も可能であり、将来のパンデミック時に迅速に中和抗体を発見するための技術的な予備軍としての役割を果たす可能性がある。
